夏季的一天，弗莱明像往常一样，在伦敦大学圣玛丽医学院的实验室里，从事着有关机体中防御因子（特别是白细胞）抵抗葡萄球菌致病因子的作用机理的课题研究工作。为了研究葡萄球菌，他全身心地扑在实验室，对这些细菌在培养过程中的变化进行仔细观察，研究影响这些变化的条件。每次当他将培养皿的盖子打开，取出里面的细菌，放在玻璃片上，准备拿到显微镜下观察时，飘浮在空气中的细菌或霉菌，常常“乘机”飘落到培养皿里，这些外来的微生物在培养皿中繁殖，经常妨碍实验的正常进行，对于这些“不速之客”，弗莱明真是讨厌极了。但是在这一天，那些“不速之客”却引他起了他的注意。当弗莱明正准备用显微镜观察从培养皿中取出的葡萄球菌时，一个特殊现象引起了他的注意，在原来长了很多金黄色葡萄球菌菌落的培养皿里，有一种来自空气中的青绿色的霉菌菌落长了出来，并已开始繁殖。
使他更为惊讶的是，在这个青绿色的菌落周围，原来培植的葡萄球菌落全被溶解了，而离得较远的葡萄球菌则依然如故。弗莱明推测这个青绿色的霉菌可能分泌了一种能够裂解葡萄球菌的自然抗菌物质，而这种物质可能正是他多年来寻求的。这种青绿色的霉菌引起了弗莱明的极大的兴趣，他详细地记录下这个偶然发现的奇特现象，同时异常小心地把这些青绿色的霉菌从培养皿中分离出来，培养在液体培养基中，让它迅速繁殖。
这种青绿色的霉菌被弗莱明称为“青霉菌”。根据青霉菌“吞食”顽固的葡萄球菌这一事实，他推测青霉菌分泌了一种极强的杀菌物质，正是这种可以扩散的物质，把周围的葡萄球菌消灭了。在整个试验过程中，他都观察得十分仔细。当葡萄球菌布满了培养皿整个平面时，青霉菌周围仍旧没有任何细菌。由此可以证明，青霉菌能阻止细菌的蔓延，并且能把它们加以消灭。
那么是否能把青霉菌的分泌物提取出来呢？弗莱明开始思考这个问题。于是，他立即动手进行实验。第一步，他把青霉菌接种到肉汤培养液中，让它迅速地繁殖；第二步，把长满青霉菌的液体异常小心地过滤出来，得到一小瓶澄清的滤液。随后，这种滤液被弗莱明滴进长满葡萄球菌的培养皿里。几个小时以后，原来长势旺盛的葡萄球菌全部被消灭了。
这个发现让弗莱明兴奋不已，他又开始了一系列实验。弗莱明在以前研究溶菌酶过程建立起来的测定技术的基础生，用水稀释这种滤液，重新做实验，鉴定这种培养液对各种致病菌的抑制性状。试验结果表明：1：1000浓度的培养液对葡萄球菌的生长仍具有抑制作用。弗莱明又以十分凶恶的链球菌作为测试的对象，结果表明，1：100培养液就能杀死它们。弗莱明称这种抗菌物质为“青霉素”。
青霉素尽管被发现了，但真正把它运用于医学上还经过了很长一段时间，因为提炼医用青霉素的过程相当困难，要经过青霉素的培养、滤液的浓缩、提炼和烘干等一系列过程，弗莱明自己是无法完成的。因此，他邀请了一些生物化学家合作，打算把培养液中的青霉提取出来供临床试用。但是这种很不稳定的化学物质，在一般的溶液中很快就遭到破坏，所有提取青霉素的试验都失败了，他也因此一直没有获得过青霉素的提取物。但是，弗莱明丝毫没有气馁，青霉素的光明前景在激励着他。十多年以来，他在自己的实验室里耐心地将这个青霉素菌株一代一代地繁殖下去，终于取得了骄人的成绩。
澳大利亚病理学家弗洛里注意到了弗莱明关于青霉素的论文，便向弗莱明索取该菌作进一步的研究。弗洛里和当时侨居在英国的德国生物化学家钱恩，在几位科学家的协助下，克服了种种困难，将青霉素的棕黄色粉末提炼了出来。经试验，这种青霉素粉末的杀伤力是前所未有的。
青霉素第一次在被葡萄球菌传染的病人身上做临床试用，效果良好。青霉素的显著疗效得到了医药界的承认并广泛地普及开来。此后，青霉素的工业制药取得了突飞猛进的发展。
