第一步，目标基因的精确定位，要求目标基因两侧各有一个与其紧密连锁的分子标记，并且目标基因座位与分子标记座位之间的遗传距离小于5厘摩。
第二步，将RFLP分子标记转换为PCR为基础的分子标记，增强检测手段的自动化程度。
第三步，采用SCAR、STS等基于PCR扩增的途径检测亲本间的多态性。
第四步，应用SCAR、STS等标记针对育种群体进行分子标记辅助选择。
1.7.4分子标记辅助选择在作物育种上的应用
由于作物新品种选育中涉及质量性状及数量性状等两个方面，从而分子标记辅助选择在作物育种上的应用主要包括如下几个方面。
（1）分子标记辅助选择在回交育种中的应用
回交是指以具有许多优良性状而个别性状欠缺的待改良品种为轮回亲本，以具有轮回亲本欠缺的优良性状的品种为非轮回亲本，两者的杂交后代又与轮回亲本进行系列的回交和选择，在回交结束时还需要1～2次的自交，以便使基因纯合，形成具有轮回亲本一系列的优良性状而少数欠缺性状得到改进的新品种的选育方式。回交选育方法适宜于对带有个别不良性状的品种改良，分子标记辅助选择应用于回交育种可以提高选择效率，加快育种进程。
1）快速有效地选择出带有目标基因的单株。分子标记辅助选择利用与目标基因紧密连锁的分子标记对是否带有目标基因的单株进行选择，大大加快了育种进程。主要表现在：
A.分子标记辅助选择不受环境条件及植株生长发育阶段的影响，因而在植株的苗期或低世代就可进行选择。
B.当目标基因为隐性基因时，利用呈现共显性遗传的分子标记可直接对其进行选择，无需进行测交或自交的检验。
C.如果目标性状不能在当代进行选择，例如玉米的淀粉含量等，采用分子标记辅助选择可直接在当代确定目标基因是否存在，而无需进行后代的品质检验。汉逊等利用4个RAPD标记，在10个BC1F2家系的4605个单株中快速选出了CMS恢复位点纯合的906个单株。此法大大节省了测交的工作量及时间，充分展现了分子标记辅助选择的优越性。
2）快速选出以轮回亲本基因组为遗传背景的单株。在回交育种中，非轮回亲本为轮回亲本导入优良性状的同时也带来了与之连锁的不良基因，这种连锁累赘现象常常使得经过改良的新品种与最初的育种目标不一致。因而在回交育种中不仅要考虑优良性状的导入，还必须考虑保持其整个基因组的遗传背景基本不变。
孟金陵等认为，通过分子标记辅助选择技术，借助于饱和的分子标记连锁图，对各选择单株进行整个基因组的组成分析，进而可以选出带有多个目标性状而且遗传背景良好的理想个体。汤斯勒等通过计算机模拟分析，结果表明，如果从每个回交世代含有目标基因的30个单株中，通过分子标记辅助选择出1株带有轮回亲本基因组比率最高的个体作为下一次回交的亲本，则完全恢复到轮回亲本基因组的基因型只需3代。在传统的育种方法中，要达到99%的轮回亲本比率则需要（6.5±1.7）代。
3）可以有效地选择目标基因附近发生重组交换的个体。在回交育种中，连锁累赘现象是影响回交育种的一个主要限制因素。传统的解决方法是通过扩大选择群体或增加回交次数来解决。斯塔尔等研究表明，即使回交20代后，还能发现相当大的与目标基因连锁的供体染色体片段，而在大多数植物基因组中10厘摩的DNA序列足够包含数百个基因。通过分子标记辅助选择可以快速减轻连锁累赘。汤斯勒等研究表明，用位于目标基因两侧1厘摩的两个分子标记进行辅助选择，通过两个世代就可获得含目标基因长度不大于2厘摩的个体。这样的结果采用传统的育种方法则需要100代才能达到。因此，分子标记辅助选择可以对目标基因附近发生了重组的个体进行鉴定。
（2）分子标记辅助选择在基因聚合中的应用
基因聚合是将多个有利基因通过选育途径聚合到一个品种中，这些基因可以控制相同的性状也可控制不同的性状，基因聚合突破了回交育种改良个别性状的局限，使品种在多个性状上同时得到改良，产生更具有实用价值的育种材料。基因聚合常在抗性育种中得到应用，育种专家将多个控制垂直抗性的基因聚合在同一个品种中可以提高作物抗病的持久性。在传统的抗病性检测中，通过接种鉴定不仅程序复杂，而且常常影响植株的生长发育，而且一些抗性基因很难找到相应的鉴定小种。采用与抗性基因紧密连锁的分子标记或相应基因的特异引物进行分子标记辅助选择，可加速抗源筛选和抗性基因的鉴定，提高育种选择效率，缩短育种周期。
（3）分子标记辅助选择在数量性状改良中的应用作物中大部分的农艺性状是由多基因控制的数量性状，在这样一个多基因体系中，每个基因对目标性状只表现微效作用，没有明显的显性，而且表现型受环境条件影响很大。因而采用传统的育种方式对这些性状进行选择有很大的难度。
分子标记辅助选择为数量性状改良提供了新的研究思路。帕特逊等认为高密度分子遗传图谱的建立，使覆盖全基因组的分子标记将控制数量性状的微效多基因分解成孟德尔遗传因子，并定位到分子标记所在的染色体上，进而按照经典的遗传模式进行研究。这就使得利用与QTL紧密连锁的分子标记对这些QTL进行转移以达到对这些数量性状的改良成为可能。但是由于数量性状遗传的复杂性，与由单基因或寡基因控制的质量性状相比，采用分子标记辅助选择对数量性状的改良仍存在以下问题：
1）QTL与环境之间的互作降低了对数量性状基因定位的准确性。
2）由于单个QTL呈微效作用，所以必须同时操作多个QTL才能使性状发生显著改变。
3）QTL之间存在互作关系，使得对QTL的效应估计发生偏差。
4）在对QTL进行转移时，如果没有转移互作QTL，则不会达到预期的效果。
岚德等研究了分子标记辅助选择在数量性状上的实用性，结果表明分子标记辅助选择可以大大提高选择的效率，另有一些研究人员也得到了相似的研究结果。
分子标记辅助选择技术是现代生物技术在作物遗传改良领域中应用的一个重要方面。实践证明，分子标记辅助选择为传统的育种提供了一种有力的辅助手段。我国利用分子标记辅助选择进行新品种选育工作已取得可喜的进展。
例如，刘金元等利用RLFP标记对小麦白粉病基因Pm2和Pm4a进行了标记辅助选择。薛庆中等应用分子标记辅助选择培育出了抗白叶枯病水稻恢复系并筛选出抗病杂交稻新组合协优T71、协优T81和汕优8548。王心宇等利用与Pm2、Pm4a、Pm8、Pm21紧密连锁或共分离的RFLP标记和PCR标记（SCAR标记），对含有这些基因的优良品系间配置的杂交组合的F2代进行了分子标记辅助选择育种，并结合抗性鉴定，筛选到14株Pm4a+Pm21的植株，16株Pro2+Pm4a的植株，6株Pm8+Pm21的植株。
