——荧光法和2，4-二硝基苯肼法（GB/T 5009.86-2003）
15.1荧光法
15.1.1原理
试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹唔啉(quinoxaline)，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除试样中荧光杂质产生的干扰。
15.1.2试剂
（1）偏磷酸-乙酸液：称取15 g偏磷酸，加入40 mL冰乙酸及250 mL水，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500 mL，于4℃冰箱可保存7～10 d。
（2）0.15 mol/L硫酸：取10 mL硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1 200 mL。
（3）偏磷酸-乙酸-硫酸液：以0.15 moI/L硫酸液为稀释液，其余同（1）配制。
（4）乙酸钠溶液(500 g/L)：称取500 g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)，加水至1000 mL。
（5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3 g硼酸，溶于100 mL乙酸钠溶液(500 g/L)中。临用前配制。
（6）邻苯二胺溶液(200 mg/L)：称取20 mg邻苯二胺，临用前用水稀释至100 mL。
（7）抗坏血酸标准溶液(1 mg／mL)（临用前配制）：准确称取50 mg抗坏血酸，用偏磷酸-乙酸溶液溶于50 mL容量瓶中，并稀释至刻度。
（8）抗坏血酸标准使用液(100 μg／mL)：取10 mL抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100 mL，定容前试pH值，如其pH>2.2时，则应用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释。
（9）0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1 g百里酚蓝，加0.02 mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75 mL，磨溶后用水稀释至250 mL。
变色范围：
pH值等于1.2红色
pH值等于2.8黄色
pH值大于4蓝色
（10）活性炭的活化；加200 g炭粉于1 L盐酸(1+9)中，加热回流1～2 h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。
15.1.3仪器
（1）实验室常用设备。
（2）荧光分光光度计或具有350 nm及430 nm波长的荧光计。
（3）捣碎机。
15.1.4分析步骤
15.1.4.1试样的制备
称取100 g鲜样，加100 mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入捣碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或蓝色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH值为1.2。均浆的取量需根据试样中抗坏血酸的含量而定。当试样液含量在40～100 μg／mL之间，一般取20 g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100 mL，过滤，滤液备用。
15.1.4.2测定
（1）氧化处理：分别取试样滤液(15.1.4.1)及抗坏血酸标准使用液(100 μg/mL)各100 mL于200 mL带盖三角瓶中，加2 g活性炭，用力振摇1 min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即试样氧化液和标准氧化液，待测定。
（2）各取10 mL标准氧化液于2个100 mL容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白”。
（3）各取10 mL试样氧化液于2个100 mL容量瓶中，分别标明“试样”及“试样空白”。
（4）于“标准空白”及“试样空白”溶液中各加5 mL硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15 min，用水稀释至100 mL，在4℃冰箱中放置2～3 h，取出备用。
（5）于“试样”及“标准”溶液中各加入5 mL 500 g/L乙酸钠液，用水稀释至100 mL，备用。
15.1.4.3标准曲线的制备
取上述“标准”溶液(5+2.5)(抗坏血酸含量10 μg/mL)0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL和2.0 mL标准系列，取双份分别置于10 mL带盖试管中，再用水补充至2.0 mL。荧光反应按15.1.4.4操作。
15.1.4.4荧光反应
取15.1.4.2(4)中“标准空白”溶液，“试样空白”溶液及15.1.4.2(5)中“试样”溶液各2 mL，分别置于10 mL带盖试管中。在暗室迅速向各管中加入5 mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35 min，于激发光波长338 nm、发射光波长420 nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算使用。
15.1.5结果计算
X=c·Vm×F×1001 000
式中：X——试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/l00 g；
C——由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度，μg/mL；
m——试样的质量，g；
V——荧光反应所用试样体积，mL；
F——试样溶液的稀释倍数。
计算结果精确到小数点后一位。
15.1.6精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15.1.7说明
本方法检出限为0.022 μg/mL，线性范围为5～20μg/mL。
15.22，4-二硝基苯肼法
15.2.1原理
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。
15.2.2试剂
（1）4.5 mol/L硫酸：谨慎地加250 mL硫酸（相对密度1.84）于700 mL水中，冷却后用水稀释至1000 mL。
（2）85%硫酸：谨慎地加900 mL硫酸(相对密度1.84)于100 mL水中。
（3）2，4-二硝基苯肼溶液(20 g/L)：溶解2 g 2，4-二硝基苯肼于100 mL 4.5 mol/L硫酸中，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。
（4）草酸溶液(20 g/L)：溶解20 g草酸(H2C2O4)于700 mL水中，稀释至1000 mL。
（5）草酸溶液(10 g/L)：取500 mL草酸溶液(9.4)稀释至1 000 mL。
（6）硫脲溶液(10 g/L)：溶解5 g硫脲于500 mL草酸溶液(10 g/L)中。
（7）硫脲溶液(20 g/L)：溶解10 g硫脲于500 mL草酸溶液(10 g/L)中。
（8）1 mol/L盐酸：取100 mL盐酸，加入水中，并稀释至1200 mL。
（9）抗坏血酶标准溶液；称取100 mg纯抗坏血酸溶解于100 mL草酸溶液(10 g/L)中，此溶液每毫升相当于1 mg抗坏血酸。
（10）活性炭：将100 g活性炭加到750 mL 1 mol/L盐酸中，回流1～2 h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110℃烘箱中烘干。
检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将20 g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。
15.2.3仪器
(1)恒温箱；37℃±0.5℃。
(2)可见-紫外分光光度计。
(3)捣碎机。
15.2.4分析步骤
15.2.4.1试样的制备
全部实验过程应避光。
(1)鲜样的制备：称取100 g鲜样及吸取100 mL 20 g/L草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10～40 g匀浆（含1～2 mg抗坏血酸）倒入100 mL容量瓶中，用10 g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。
(2)干样制备：称1～4 g干样（含1～2 mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入10 g/L草酸溶液磨成匀浆，倒入100 mL容量瓶内，用10 g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。
(3)将(1)和(2)液过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离心后，倾出上清液，过滤，备用。
15.2.4.2氧化处理
取25 mL上述滤液，加入2 g活性炭，振摇1 min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10 mL此氧化提取液，加入l0 mL 20 g/L硫脲溶液，混匀，此试样为稀释液。
15.2.4.3呈色反应
(1)于三个试管中各加入4 mL稀释液(15.2.4.2)。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0 mL 20 g/L 2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37℃±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。
(2)3 h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0 mL 20 g/L 2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15 min后放入冰水内。其余步骤同试样。
15.2.4.485%硫酸处理
当试管放入冰水后，向每一试管中加入5 mL 85%硫酸，滴加时间至少需要1 min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30 min后比色。
15.2.4.5比色
用1 cm比色杯，以空白液调零点，于500 nm波长测吸光值。
15.2.4.6标准曲线的绘制
(1)加2g活性炭于50 mL标准溶液中，振动1 min，过滤。
(2)取10 mL滤液放入500 mL容量瓶中，加5.0 g硫脲，用10 g/L草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度20 μg/mL。
(3)取5 mL，10 mL，20 mL，25 mL，40 mL，50 mL，60 mL稀释液，分别放入7个100 mL容量瓶中，用10 g/L硫脲溶液稀释至刻度，使最后柿释液巾抗坏血酸的浓度分别为1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL，5 μg/mL，8 μg/mL，10 μg/mL，12 μg/mL。
(4)按试样测定步骤形成脎并比色。
(5)以吸光值为纵坐标，抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。
15.2.5结果计算
X=c·Vm×F×1001000
式中：X——试样中总抗坏血酸含量，mg/100 g；
c——由标准曲线查得或由回归方程算得“试样氧化液”中总抗坏血酸的浓度，μg/mL；
v——试样用10 g/L草酸溶液定容的体积，mL；
F——试样氧化处理过程中的稀释倍数；
m——试样的质量，g。
计算结果精确到小数点后两位。
15.2.6精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15.2.7说明
本方法检出限0.1 μ/mL。线性范围：为1～12 μg/mL。
