根据流出曲线方程，色谱柱的理论塔板高度被定义为单位柱长度的色谱峰方差：
H=σ2L
理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中的塔板数越多，分离效果越好。决定理论塔板高度的因素有固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。
塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。例如，塔板理论认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有径向扩散，这些都不符合色谱柱实际情况，因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱的效能，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。
16.3.3.3范第姆特方程
范第姆特方程（Van Deemter Equation）是对塔板理论的修正，用于解释色谱峰扩张和柱效降低的原因。范第姆特方程将峰形的改变归结为理论塔板高度的变化，理论塔板高度的变化则源于若干原因，包括涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等。
涡流扩散由于色谱柱内固定相填充的不均匀性，同一个组分会沿着不同的路径通过色谱柱，从而造成峰的扩张和柱效的降低。
纵向扩散是由浓度梯度引起的，组分集中在色谱柱的某个区域会在浓度梯度的驱动下沿着径向发生扩散，使得峰形变宽柱效下降。
传质阻抗本质上是由达到分配平衡的速率带来的影响。实际体系中，组分分子在固定相和流动相之间达到平衡需要进行分子的吸附、脱附、溶解、扩散等过程，这种过程称为传质过程，阻碍这种过程的因素叫做传质阻抗。在理想状态中，色谱柱的传质阻抗为零，组分分子流动相和固定相之间会迅速达到平衡。在实际体系中传质阻抗不为零，这导致色谱峰扩散，柱效下降。
在气相色谱中范第姆特方程形式为：
H=A+Bμ+Cμ
式中：H——理论塔板高度；
A——涡流扩散系数；
B——纵向扩散系数；
C——传质阻抗系数；
μ——流动相流速。
在高效液相色谱中，由于流动相黏度远远高于气相色谱，纵向扩散对峰型的影响很小，可以忽略不计，因而范第姆特方程的形式为：
H=A+Cμ
16.3.4色谱仪
16.3.4.1气相色谱仪
气相色谱系统包括可控而纯净的载气源(它能将样品带入GC系统进样口，同时还作为液体样品的气化室)、色谱柱（实现随时间的分离）、检测器（当组分通过时，检测器电信号的输出值改变，从而对组分做出响应）和数据处理装置。
气相色谱仪常用的7种检测器为：①氢火焰离子化检测器（FID）用于微量有机物分析；②热导检测器（TCD）用于常量、半微量分析，有机、无机物均有响应；③电子捕获检测器（ECD）用于有机氯农药残留分析；④火焰光度检测器（FPD）用于有机磷、硫化物的微量分析；⑤氮磷检测器（NPD）用于有机磷、含氮化合物的微量分析；⑥催化燃烧检测器（CCD）用于对可燃性气体及化合物的微量分析；⑦光离子化检测器（PID）用于对有毒有害物质的痕量分析。
16.3.4.2液相色谱仪
同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。对高沸点、难气化化合物的混合物通过色谱柱和洗脱液选择实现分离。利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混合物进行先分离后分析鉴定的仪器。与经典液相柱色谱装置比较，具有高效、快速、灵敏等特点。
现代液相色谱仪由储液器、高压泵、进样器、色谱柱、检测器、温度控制系统、进样系统、信号记录系统和馏分收集器等部分组成。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以数字和图谱形式输出。
常见的液相色谱仪检测器有：①紫外检测器，光源为D2灯，主要用于检测波长小于等于400 nm紫外区内具有紫外吸收的成分。②紫外-可见光用检测器，采用D2灯和钨灯作为光源，可检测物质范围宽，吸收光波长为190~900 nm，灵敏度很大程度上取决于物质成分，对于检测色素和着色剂等有色成分十分有效。③二极管阵列检测器（DAD），可收集从紫外区到可见光区的光谱数据，每种物质成分光谱可以确认。④荧光（FL）检测器，可专门用于检测荧光物质，灵敏度高，常用于柱前柱后衍生性检测。⑤示差折光（RI）检测器，可检测到任何与洗出液折射率不同的物质成分，对于紫外区无吸收的成分，但灵敏度较低，不能用于梯度分析。⑥蒸发光散射检测器（ELSD），将色谱洗脱液雾化后，检测生成微粒物质成分的散射光。对非紫外吸收成分探测灵敏度高。⑦电导检测器（CD），可检测电离成分，主要用于离子色谱法。⑧电化学检测器（ECD），可检测到电氧化-还原反应产生的电流，检测电活性物质成分，灵敏度高。⑨Corona电雾式检测器（CoronaCAD），使洗脱液雾化并检测经过电晕放电处理后的生成微粒成分。检测紫外非吸收成分灵敏度比蒸发光散射检测器高，是一种全新的HPLC通用检测器，适用于制药、食品、工业化学制品、聚合物、生命科学研究、消费品等行业。
16.3.5色谱试剂
16.3.5.1固定相
色谱柱是色谱的心脏，样品的分离是在色谱柱上完成的。在色谱柱中不能移动而能起分离作用的物质称为固定相。固定相分两大类，一类是具有吸附性的多孔固体物质，也称为吸附剂；另一类是能起分离作用的液体物质称为固定液。固定液涂布在载体上常用的固体吸附固定相有吸附剂、高分子多孔小球和化学键合固定相。吸附剂中有硅胶、活性炭、石墨化碳黑、碳分子筛以及氧化铝和分子筛等。高分子多孔小球包括国产的 GDX 和400系列，国外的Chromosorb与 Porpark系列。
16.3.5.2固定液
固定液大概有几百种，一般常按其极性和化合物结构进行分类。按固定液极性可分为非极性、中极性和强极性三种。非极性固定液的相对极性在 0、+1 之间，例如常用的固定液有角鲨烷、阿皮松类及甲基硅氧烷类等；中等极性固定液的相对极性在+2、+3之间，这类固定液适宜分离中等极性物质，常用的固定液有邻苯二甲酸二壬酯、聚乙二醇酯等；强极性固定液的相对极性约为+3、+4，对极性物质溶解度很大，常用的有β，β′-氧二丙腈、聚乙二醇等。
16.3.5.3高压液相色谱淋洗剂
高压液相色谱淋洗剂又称流动相或洗脱剂，是高压液相色谱分析中必不可少的试剂，其作用一是携带样品前进，二是为分析样品提供分配相，进而调节选择性，达到混合样品的分离。高压液相色谱法根据固定相的类型和分离原理可分为液固吸附色谱法、液-液分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法等几大类。一般情况下，不同种类液相色谱选择不同的流动相。极性大的试样用极性强的洗脱剂；极性弱的样品用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数(εo)衡量。εo越大表示洗脱剂的极性越强，即洗脱剂对吸附在固定相上溶质的洗脱能力越强。
16.3.6结果解析
色谱分析的直接数据形式是色谱流出曲线即色谱图（图16-12），根据色谱图上的信息，对被测物进行定性或/和定量分析。
16.3.6.1色谱定性分析
利用保留值定性是色谱分析最基本的定性方法，其基本依据是：两个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留值。但是，相反的结论却不成立，即，在相同的色谱条件下，具有相同的保留值的两个物质不一定是同一个物质。这就使得使用保留值定性时必须十分慎重。由于影响保留值的因素——色谱中的固定相和流动相在气相色谱和液相色谱中不完全相同，因此用保留值定性的方法在气相色谱和液相色谱中也不尽相同。
16.3.6.1.1利用已知物直接对照进行定性分析
利用已知物直接对照法定性是一种最简单的定性方法，在具有已知标准物质的情况下常使用这一方法。将未知物和已知标准物在同一根色谱柱上，用相同的色谱操作条件进行分析，对色谱图进行比较。此推测只是初步的，如要得到准确的结论，有时还需要进一步的确认。在利用已知纯物质直接对照进行定性时可利用保留时间（tR）直接比较，这时要求载气流速，载气温度和色谱柱温度一定要恒定，否则会对定性结果产生影响。使用保留体积（VR）定性，虽可避免载气流速变化的影响，但实际使用很困难，因为保留体积的直接测定很困难，一般都是利用流速和保留时间计算保留体积。为了避免载气流速和温度的微小变化而引起的保留时间的变化对定性分析结果带来的影响，可采用以下两个方法：
(1)用相对保留值定性：由于相对保留值是被测组分与加入的参比组分（其保留值应与被测组分相近）的调整保留值之比，因此，当载气的流速和温度发生微小变化时，被测组分与参比组分的保留值会同时发生变化，而它们的比值——相对保留值则不变。也就是说，相对保留值只受色谱柱温和固定相性质影响，而柱长、固定相的填充情况（即固定相的紧密情况）和载气的流速均不影响相对保留值。因此，在柱温和固定相一定时，相对保留值为定值。
（2）用已知物增加峰高法定性：在得到未知样品的色谱图后，在未知样品中加入一定量的已知纯物质，然后在同样的条件下进行色谱分析，对比两张色谱图，峰高增加则表明该峰是加的已知纯物质的色谱峰。这一方法既可避免载气流速的微小变化对保留时间的影响而影响定性分析的结果，又可避免色谱图图形复杂时准确测定保留时间的困难。
16.3.6.1.2利用文献值对照进行定性分析
在利用已知标准物直接对照定性时，获得已知标准物质往往很困难。一个实验室不可能备各种各样的已知标准物质。为此，1958年匈牙利色谱学家E Kovats首先提出用保留指数（I）（Retention Index）作为保留值的标准用于定性分析，这是使用最广泛并被国际上公认的定性指标，具有重现性好（精度可达正负0.1指数单位或更低一些），标准物统一及温度系数小等优点。
保留指数仅与柱温和固定相性质有关，与色谱条件无关。不同的实验室测定的保留指数的重现性较好，精度可达正负0.3个指数单位。
用保留指数定性时需要知道被测的未知物是属于哪一类的化合物，然后查找分析该类化合物所用的固定相和色谱柱温等色谱条件。一定要在给定用色谱条件下分析未知物，并计算它的保留指数，然后再与文献中所给出的保留指数值进行对照，给出未知物的定性分析结果。
虽然保留指数定性与用已知物直接对照定性相比，避免了寻找已知标准物质的困难，但它也有一定的局限性，对一些多官能团的化合物和结构比较复杂的天然产物是无法采用保留指数定性的。
同一物质在同一柱上的保留指数与色谱柱温的关系通常是线性的，利用这一规律可以用内插法求得不同温度下的保留指数。例如某物质的保留指数，在100℃时为654，150℃时为688，用内插法可求得在125℃时为671。由于不同物质的这一线性关系往往不平行。因此可以利用两个或三个不同温度时的保留指数进行对照，使定性分析的结果更为可靠。
保留指数定性与用已知物直接对照定性一样，定性结果的准确度往往也需再用其他方法加以确认。随着计算机技术的发展，大量的保留指数可以储存在计算机中，并可以通过计算将储存在计算机中的标准保留指数转换成用户色谱条件下的保留指数和保留时间(t′R），然后用计算机的检索功能进行定性分析。
16.3.6.1.3利用保留值规律进行定性分析
无论采用已知物直接对照定性，还是采用保留指数对照定性，其准确度都不是很高，往往还需要其他方法再加以确认。如果将已知物直接对照定性与保留值规律定性结合，则可以大大提高定性分析结果的准确度。
