本章学习重点：
了解常见仪器分析的分类和原理；
了解光分析法、色谱分析法、核磁共振波谱法、质谱法在食品分析中的应用。
16.1仪器分析法简介
随着分析仪器的不断开发，仪器分析法的应用范围越来越广，在食品分析中的应用也越来越深入，几乎所有仪器分析法都能用于食品分析。但对于本科生而言，常用的仪器手段有限。因此，这里只做概略介绍，为以后的进一步学习或应用提供背景知识。
仪器分析法分为：电化学分析法、光分析法、热分析法、色谱分析法、质谱分析法及仪器分析法联合使用等。电化学分析法分为：电位分析法、电导分析法、库仑分析法、电解分析法、电泳分析法和极谱与伏安分析法。色谱分析法有：气相色谱法、液相色谱法、超临界色谱法、电色谱法、激光色谱法等。光分析法有分子光谱法和原子光谱法。分子光谱法有可见-紫外光谱法、红外光谱法、核磁共振波谱法、荧光光谱法；原子光谱又分为原子吸收光谱法和原子发射光谱法。仪器分析的特点是灵敏度高，选择性好，操作简单，分析速度快，易于实现自动化，但相对误差较大，仪器昂贵，分析成本高。
16.2光分析法
光分析法是基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系建立起来的分析方法，有光谱法和非光谱法。光分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可取代的地位，其相互作用方式有发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等。
光谱法是基于物质与辐射能作用时，分子发生能级跃迁而产生的发射、吸收或散射的波长或强度进行分析的方法，相应的分析方法分类如图16-1所示。光谱法有原子光谱法和分子光谱法。最常见原子光谱（线性光谱）法有三种：基于原子外层电子跃迁的原子吸收光谱法（Atomic Absorption Spectroscopy，AAS）、原子发射光谱（AES）、原子荧光光谱法（Atomic Emission Spectrometry，AFS），基于原子内层电子跃迁的X射线荧光光谱法（X-ray Fluorescence Spectrometry，XFS）和基于原子核与射线作用的穆斯堡尔谱法（Mossbauer Spectroscopy）。
分子光谱（带状光谱）基于分子中电子能级、振-转能级跃迁，有紫外光谱法（Ultraviolet Spectrometry，UV）、红外光谱法（Infrared，IR）、分子荧光光谱法（Molecule Fluorescence Spectrum，MFS）、分子磷光光谱法（Molecular Phosphorescence Spectroscopy，MPS）和核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR)与(电子)顺磁共振波谱（Electron Paramagnetic Resonance，EPR，又称电子自旋共振Electron Spin Resonance，ESR）。
非光谱法不涉及能级跃迁，光作用于物质后，仅发生传播方向等物理上的性质改变。分析方法有偏振法、干涉法、旋光法等。
(1)原子发射光谱分析法：以火焰、电弧、等离子炬等作为光源，使气态原子的外层电子受激，发射出特征光谱进行定量分析的方法。
(2)原子吸收光谱分析法：利用特殊光源发射出待测元素的共振线，并将溶液中离子转变成气态原子后，测定气态原子对共振线吸收而进行的定量分析方法。
(3)原子荧光分析法：气态原子吸收特征波长的辐射后，外层电子从基态或低能态跃迁到高能态，在10~8 s后跃回基态或低能态时，发射出与吸收波长相同或不同的荧光辐射，在与光源成90度的方向上，测定荧光强度进行定量分析的方法。
(4)分子荧光分析法：某些物质被紫外光照射激发后，在回到基态的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，通过测量荧光强度进行定量分析的方法。
(5)分子磷光分析法：处于第一最低单重激发态分子以无辐射弛豫方式进入第一、三重激发态，再跃迁返回基态发出磷光。测定磷光强度进行定量分析的方法。
(6)X射线荧光分析法：原子受高能辐射，其内层电子发生能级跃迁，发射出特征X射线（X射线荧光），测定其强度可进行定量分析。
(7)化学发光分析法：利用化学反应提供能量，使待测分子被激发，返回基态时发出一定波长的光，依据其强度与待测物浓度之间的线性关系进行定量分析的方法。
(8)紫外-可见吸收光谱分析法：利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长强度变化可进行定量分析。
(9)红外吸收光谱分析法：利用分子中基团吸收红外光产生的振动-转动吸收光谱进行定量和有机化合物结构分析的方法。
(10)核磁共振波谱分析法：在外磁场的作用下，核自旋磁矩与磁场相互作用而裂分为能量不同的核磁能级，吸收射频辐射后产生能级跃迁，根据吸收光谱可进行有机化合物结构分析。
(11)顺磁共振波谱分析法：在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁，根据吸收光谱可进行结构分析。
(12)旋光法：溶液的旋光性与分子的非对称结构有密切关系，可利用旋光法研究某些天然产物及配合物的立体化学问题，如旋光计测定糖和味精的含量等。
(13)衍射法：X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具有不同衍射图。
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的基础，研究物质的内部组织结构。
16.2.1可见-紫外光谱法
16.2.1.1概述
紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为200~780 nm范围的电磁波的吸收特性建立的一种定性、定量和结构分析方法。该法操作简单、准确度高、重现性好。长波长(频率小)的光线能量小，短波长(频率大)的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。
描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线，称为吸收光谱或吸收曲线。紫外-可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和反键电子）有关。1852年，比尔(Beer)参考了布给尔(Bouguer)1729年和朗伯(Lambert)在1760年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例，也就是着名的比尔-朗伯定律（Beer-Lambert law），适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。这个定律表示：当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为l，浓度为c的吸光物质时，由于介质吸收了一部分光能，透射光的强度就要减弱。吸收介质的浓度越大，介质的厚度越大，则光强度的减弱越显着。其关系为：辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。其数学表达式为：
A=logI0It=log1T=Klc
式中：A——吸光度；
I0——入射辐射强度；
It——透射光的强度；
T——透射比，或称透光度；
K——系数，可以是吸收系数或摩尔吸收系数；K值越大，分光光度法测定的灵敏度越高；
l——吸收介质的厚度，一般以cm为单位；
c——吸光物质的浓度，单位可以是g/L或mol/L。
当介质中含有多种吸光组分时，只要各组分间不存在着相互作用，则在某一波长下介质的总吸光度是各组分在该波长下吸光度的加和，这一规律称为吸光度的加合性。
比尔-朗伯定律的成立是有前提的，即：
(1)入射光为平行单色光且垂直照射；
(2)吸光物质为均匀非散射体系；
(3)吸光质点之间无相互作用；
(4)辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生。
根据比尔-朗伯定律，当吸收介质厚度不变时，A与c之间应该成正比关系，但实际测定时，标准曲线常会出现偏离比尔-朗伯定律的现象，有时向浓度轴弯曲（负偏离），有时向吸光度轴弯曲（正偏离）。造成偏离的原因是多方面的，主要是测定时的实际情况不完全符合使比尔-朗伯定律成立的前提条件。物理因素有：①非单色光引起的偏离；②非平行入射光引起的偏离；③介质不均匀引起的偏离。化学因素有：溶液浓度过高引起的偏离和化学反应（如水解、解离）引起的偏离。
16.2.1.2紫外-可见分光光度计
1854年，杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)等将比尔-朗伯定律应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外-可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度也不断提高，其应用范围也不断扩大。紫外-可见分光光度计由5个部件组成，如图16-3所示。
（1）辐射源。必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500 nm），氘灯或氢灯（180～460 nm），或可调谐染料激光光源等。
（2）单色器。由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。
（3）试样容器，又称吸收池。供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为0.5～10 cm。
（4）检测器，又称光电转换器。常用的有光电管或光电倍增管，后者较前者更灵敏，特别适用于检测较弱的辐射。现在还使用光导摄像管或光电二极管矩阵作检测器，具有快速扫描的特点。
（5）显示装置。这部分装置发展较快。较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
分光光度计仪器类型有单波长单光束直读式分光光度计，单波长双光束自动记录式分光光度计和双波长双光束分光光度计。
16.2.1.3紫外-可见分光光度法应用
紫外-可见分光光度法应用范围广泛，包括：①定量分析，广泛用于各种物料中微量、超微量和常量的无机和有机物质的测定。②定性和结构分析，紫外吸收光谱可用于推断空间阻碍效应、氢键的强度、互变异构、几何异构现象等。③反应动力学研究，即研究反应物浓度随时间而变化的函数关系，测定反应速度和反应级数，探讨反应机理。④研究溶液平衡，如测定络合物的组成，稳定常数、酸碱离解常数等。紫外-可见分光光度法应用很普遍，以下是一些与食品分析相关的应用实例。
（1）饮料中的咖啡因含量测定。采用三氯甲烷为萃取剂，控制三氯甲烷与饮料的体积比为8∶1，经充分振荡后离心分离，取清液在276 nm 处测定紫外吸收光谱，能够满意地测定市售饮料中的咖啡因浓度，分析结果的相对标准偏差小于4%；在饮料中加入不同浓度的咖啡因标准溶液，回收率在94.0%~112.0%之间。
（2）藤茶中总黄酮测定。以乙醇为溶剂提取藤茶中总黄酮，用三氯化铝作为显色剂，采用三波长紫外光谱法进行定量。结果表明，黄酮质量浓度在0 ～ 40 μg/mL内，分别在波长为λ1=322 nm、λ2=311 nm、λ3=296 nm处测吸光度时，ΔA与质量浓度C之间呈良好的线性关系，相关系数r =0.9978。方法的回收率为98.18%～102.79%，变异系数小于0.371%。
（3）金银花提取物中有机酸含量测定。以高效液相色谱法（HPLC）为参照，测定金银花提取物中绿原酸、咖啡酸、3，4-咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸的含量。在220～400 nm范围内扫描金银花提取物溶液的紫外吸收光谱，采用偏最小二乘法分别建立样品紫外吸收光谱与5 种有机酸含量之间的校正模型。5个校正模型对预测集样本的预测值与对照值的相关系数都在0.90以上，相对预测误差分别为1.46%，-2.13%，0.42%，6.40%，3.83%，预测结果准确。
