原理及其应用
【教学目标】
第一节分子杂交与印迹技术
掌握：分子杂交和印迹技术的原理。
了解：印迹技术的类别及应用。
第二节PCR技术的原理与应用
掌握：PCR的工作原理、主要用途。
熟悉：PCR实验条件。
第三节核酸序列分析
熟悉：化学裂解法；DNA链末端合成终止法。
【考评测试】
一、单项选择题
1.分子杂交试验不能用于（ ）
A.单链DNA分子之间
B.单链DNA分子与RNA分子之间
C.抗原与抗体分子之间
D.双链DNA与RNA之间
E.RNA与RNA分子之间
2.了解某一基因在某组织细胞中的表达水平时，采用哪种方法最合适（ ）
A.Southernblotting
B.Northernblotting
C.Westernblotting
D.免疫组化分析
E.Dotblotting
3.标记DNA探针时目前最常用的技术是（ ）
A.缺口平移
B.随机引物标记法
C.PCR法
D.RT‐PCR法
E.Southernblotting
4.下列关于DNA序列自动化测定的描述中，不正确的是（ ）
A.荧光标记代替同位素标记
B.激光扫描分析代替人工读序
C.基本原理与手工测序相同
D.不需要引物
E.需要模板
5.用于测序的DNA末端终止法中不需要（ ）
A.四种2′-脱氧核苷酸（dNTP）
B.四种2′-，3′双脱氧核苷酸（ddNTP）
C.DNA聚合酶
D.32P或35S标记的一种dNTP
E.DNA连接酶
6.不经电泳分离直接将样品点在NC膜上的技术是（ ）
A.Southernblotting
B.Northernblotting
C.Westernblotting
D.insituhybridization
E.Dotblotting
7.用于自动化PCR仪的DNA聚合酶必须（ ）
A.耐热
B.耐压
C.耐酸
D.耐碱
E.以上都具备
8.PCR的循环次数一般是（ ）
A.5～10次
B.10～15次
C.15～20次
D.20～25次
E.25～30次
9.Sanger法测序不需要（ ）
A.Klenow小片段
B.dNTP
C.标记dNTP
D.ddNTP
E.引物
10.1996年，英国科学家克隆Dolly羊所采用的技术是（ ）
A.转基因技术
B.核转移技术
C.基因剔除技术
D.肽-核酸技术
E.反义核酸技术
11.PCR实验的特异性主要取决于（ ）
A.DNA聚合酶的种类
B.反应体系中模板DNA的量
C.引物序列的长度和结构
D.四种dNTP的浓度
E.循环周期的次数
12.Maxam‐Gilbert法和Sanger法测序的共同点是均需要（ ）
A.引物
B.Klenow大片段
C.ddNTP
D.化学裂解试
E.电泳后放射自显影读图
13.经电泳分离后将蛋白质转移到NC膜上的技术是（ ）
A.Southernblotting
B.Northernblotting
C.Westernblotting
D.insituhybridization
E.Dotblotting
14.反义核酸作用主要是（ ）
A.封闭DNA
B.封闭RNA
C.降解DNA
D.降解RNA
E.封闭核糖体功能
15.用于核酸杂交的探针至少应符合（ ）
A.必须是双链DNA
B.必须是双链RNA
C.必须是单链DNA
D.必须是100bp以上的大分子DNA
E.必须是蛋白质
16.免疫印迹技术中不适合应用的步骤是（ ）
A.聚丙烯酰胺凝胶电泳
B.用NC膜或PVDF膜
C.用毛细管作用进行转移
D.用同位素标记抗体
E.用非同位素标记抗体
17.某种遗传性疾病由同一个点突变（无限制性内切酶位点变化）引起，可以（ ）
A.用DNA单链构象多态性分析突变
B.用限制性片段长度多态性分析突变
C.用Westernblotting分析突变
D.用电泳分析基因组DNA
E.用电泳分析细胞中的所有蛋白质
18.基因治疗的基本策略不包括（ ）
A.基因芯片
B.基因增补
C.基因失活
D.基因疫苗
E.缺陷基因精确的原位修复
19.PCR反应过程中，模板DNA变性所需温度一般是（ ）
A.95℃
B.85℃
C.72℃
D.55℃
E.45℃
20.同位素标记探针检测NC膜上的DNA样品所采用的技术是（ ）
A.Southernblotting
B.Northernblotting
C.Westernblotting
D.insituhybridization
E.Dotblotting
二、多项选择题
1.下列常用于标记探针的是（ ）
A.放射性核素
B.生物素
C.荧光染料
D.地高辛标记
E.分子信标
2.蛋白质印迹技术中可以用以下哪种方法标记抗体（ ）
A.碱性磷酸酶
B.125I
C.α‐32P‐dATP
D.辣根过氧化物酶
E.3HUR
3.Westernblotting的操作包括（ ）
A.裂解细胞制备样品
B.聚丙烯酰胺凝胶电泳
C.转移样品到NC膜上
D.封闭无关位点
E.标记核酸探针
4.有关转基因技术的正确描述是（ ）
A.将目的基因转入胚胎细胞
B.将目的基因转入胚胎干细胞
C.将目的基因整合入受精卵细胞核DNA中
D.基因转移能在同种异体之间进行
E.基因转移可以在异种动物间进行
5.从动物体内除去某种基因的技术称为（ ）
A.基因靶向灭活
B.基因剔除
C.基因转移
D.基因克隆
E.基因重排
6.PCR技术的主要用途包括（ ）
A.目的基因的克隆
B.基因的体外突变
C.DNA或RNA的微量分析
D.DNA序列测定
E.基因突变分析
7.下列哪些是单基因决定的疾病（ ）
A.高血压
B.糖尿病
C.肿瘤
D.高脂蛋白血症
E.β-地中海贫血
8.PCR反应体系包括（ ）
A.模板DNA
B.Taq‐DNA聚合酶
C.两个特异性引物
D.四种dNTP
E.含Mg2＋的缓冲液
9.疾病相关基因的检测方法包括（ ）
A.异源双链技术
B.定位突变
C.单链构象多态性分析
D.基因剔除
E.氨基酸成分分析
10.基因治疗的基本策略包括（ ）
A.基因芯片
B.基因增补
C.基因失活
D.基因疫苗
E.缺陷基因精确的原位修复
三、名词解释
1.探针
2.逆转录PCR（RT‐PCR）
3.cDNA文库
4.基因诊断
5.基因治疗
四、简答题
1．简述聚合酶链反应（PCR）反应体系的基本成分及基本反应步骤。
【科学素养读物】
PCR的故事
PCR的中文全称是聚合酶链（式）反应（polymerasechainreaction），是20世纪80年代中期由美国西特斯生物技术公司人类遗传研究室的生物化学家穆里斯（K.B.Mullis）发明的体外DNA扩增技术。PCR最大的特点是能够在数小时内将微量的目的基因或一小段DNA扩增几十万甚至上百万倍，因而又称为无细胞分子克隆法。PCR的原理及做法其实不难，它利用DNA双链复制的原理，将一条DNA序列不断加以复制，使其数量以几何级数方式增加，可用来做定性的分析及各式各样的应用。
穆里斯是一名生物化学家，1972年在加州大学伯克利分校取得博士学位，特别擅长有机物的合成。1977年，他进入旧金山加州大学医学院的药物化学实验室。1979年，穆里斯进了湾区一家名叫“西特斯”（PE‐Cetus）的私人生物技术公司任职。西特斯公司从20世纪70年代以制造维生素及抗生素为主的公司转型，进入80年代以基因产品为主的研发。西特斯公司聘用穆里斯，是想借重他有机化学合成的专长，负责合成寡核苷酸（短链DNA分子），以供实验所需。
关于PCR技术的发明，穆里斯是这样描述的。1983年春天的一个晚上，27岁的穆里斯带着女友开车前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，同时思考着用Sanger法做DNA序列分析时，是否可以在目的基因的下游互补链上增加一条引物，使得两条链的分析结果可以相互确认。问题是，如果反应过于迅速而合成了新链全长，就无法进行序列分析了。突然，穆里斯意识到：重复这一过程无疑将使位于两个引物之间的特异性序列得到扩增。穆里斯原以为这样简单的想法应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。1983年8月，穆里斯首次在公司里正式做了有关PCR原理的报告。从1983年9月起，穆里斯陆续进行了一些实验着手证明这个构想的可行性。换过几个DNA模板，也尝试不同的加热、降温周期，结果都不够稳定，顶多只在电泳凝胶上形成一条若有若无的线条，未能说服旁人PCR发挥了增幅的功效。1984年11月，穆里斯的技术员首次取得可信的结果，证明了PCR的可行性。1985年12月20日，《科学》周刊上发表了西特斯公司技术员Saiki关于PCR应用的一篇论文。1987年初，穆里斯关于PCR理论的论文发表在《酶学方法》上。经冷泉港实验室的沃森（DNA双螺旋结构的发现人之一）推荐，穆里斯在1986年5月举行的“人类分子生物学”专题研讨会中，报告了PCR的原理及实际应用结果。
PCR操作过程中需要反复加热与降温的步骤，而前一次循环所使用的大肠杆菌DNA聚合酶在高温下就变性了，因此在每一次冷热循环之后，都要加入新鲜的聚合酶。这个做法不但繁琐，并且昂贵。1986年春，穆里斯首度提出使用耐高温酶的想法。经过文献搜索，在1976年的《细菌学杂志》上找到了相关的内容。一位来自台湾的年轻科学家钱嘉韵从黄石公园的热泉里发现的嗜热菌中成功分离出该细菌耐高温的TaqDNA聚合酶。1986年6月，Saiki首次将按着钱嘉韵等人发表的步骤分离出纯化的TaqDNA聚合酶应用于PCR，效果好得惊人。TaqDNA聚合酶不但大大简化了PCR工作，同时专一性及活性都比之前使用的酶更强，背景杂讯也几乎都消除了。自此，PCR取得了完全的成功。
PCR技术的产生是基础科学研究的一项重大成果，主要的发明人穆里斯个人的贡献是巨大的，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。但PCR技术并不是穆里斯个人的成就，它是在之前一系列成果的基础上发展出来的一项新技术。例如，ArthurKornberg于1955年首次发现DNA聚合酶，并于1958年首次纯化成功；1955-1970年间，科学家发现了DNA退火及引物沿5′-→3′方向延伸的热动力学过程；KjellKleppe博士首次完成PCR试验，并提出了体外进行DNA复制的可能性；1971年HarGobindKhorana首次提出扩增合成DNA的观点，并详尽地阐述PCR的理论等。
（李春洋）
模拟测试题
第一套
一、单项选择题（每题1分，共50分）
1.维系蛋白质分子中的α-螺旋的化学键是（ ）
A.肽键
B.氢键
C.离子键
D.疏水键
E.二硫键
2.临床上用酒精消毒灭菌是利用蛋白质的哪种理化性质（ ）
A.沉淀作用
B.高分子性质
C.变性作用
D.两性作用
E.等电点
3.在形成嘌呤核苷酸时，嘌呤碱基与戊糖的N糖苷键是通过（ ）
A.嘌呤碱的N-9与戊糖的C1′连接
B.嘌呤碱的N-7与戊糖的C1′连接
C.嘌呤碱的N-9与戊糖的C2′或C3′连接
D.嘌呤碱的N-9与戊糖的C5′连接
E.嘌呤碱的N-3与戊糖的C1′连接
4.酶对它所催化反应的作用机制是（ ）
A.使反应活化能增加
B.使反应活化能降低
C.使产物量增加
D.降低反应的自由能
E.受理化因素影响
5.当［S］＝4Km时，酶促反应与Vmax之比是（ ）
A.1∶5
B.2∶5
C.3∶5
D.4∶5
E.1∶1
6.酶的竞争性抑制剂的特点是（ ）
A.当底物浓度增加时，抑制作用不减弱
B.抑制剂的结构与底物不相似
C.抑制剂和酶的活性中心的结合部位相结合
D.当抑制剂的浓度增加时，酶变性失活
E.Ki是酶和抑制剂结合成酶抑制剂复合物的平衡常数
7.具有转移一碳单位功能的是（ ）
A.叶酸
B.四氢叶酸
C.蝶酸
D.对氨基苯甲酸
E.谷氨酸
8.下列哪组酶是糖酵解的关键酶（ ）
A.己糖激酶、6-磷酸果糖激酶2、丙酮酸激酶
B.己糖激酶、磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶
C.6-磷酸果糖激酶1、醛缩酶、丙酮酸激酶
D.己糖激酶、丙酮酸激酶、醛缩酶
E.己糖激酶、6-磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶
9.骨骼肌中每摩尔葡萄糖在有氧及无氧条件下彻底氧化净生成ATP的比值是（ ）
A.2∶1
B.6∶1
C.15∶1
D.18∶1
E.16∶1
10.位于糖酵解、糖异生、磷酸戊糖、糖原合成、糖原分解各条代谢途径交汇点的化合物是（ ）
A.1磷酸葡萄糖
B.6磷酸果糖
C.1，6二磷酸果糖
D.3磷酸甘油醛
E.6磷酸葡萄糖
11.各种细胞色素在呼吸链中的排列顺序是（ ）
A.c→b→c1→aa3→O2
B.c→c1→b→aa3→O2
C.c1→c→b→aa3→O2
D.b→c1→c→aa3→O2
E.b→c→c1→aa3→O2
