3.2.2.2提取与纯化
提取的总体要求是最大限度地把有效成分提出来，关键是溶剂的选择。提取的溶剂随药物的性质而异，如白蛋白可以用水来提取，为做到重复性较强，以较稀的缓冲液为宜；胰岛素则用50％的乙醇提取。一般都在较低温度下如0℃左右进行，个别的需适当提高温度，但要注意温度高会引起变性。
纯化就是将某种蛋白质与其他蛋白质杂质分离开来。纯化方法需利用分离形状与相对分子质量大小、电离性质、溶解度及生物功能的专一性差别，使用沉淀、层析、膜分离等多种技术使蛋白质达到药用质量标准。
3.2.2.3降钙素生产举例
降钙素可抑制破骨细胞活动，减弱溶骨过程，增强成骨过程，使骨组织释放的钙磷减少，钙磷沉积增加，因而血钙与血磷含量下降。临床上可用于：①治疗变形性骨炎；②治疗老年性骨质疏松症；③治疗骨转移性肿瘤、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺癌和甲状腺功能亢进引起的高血钙症。此外，口服后可直接抑制胃壁细胞分泌胃酸，治疗胃及十二指肠溃疡；亦可用于高磷酸血症及早期诊断甲状腺髓样癌等。
降钙素分子量约3500，溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、异丙醇等，难溶于有机酸。降钙素广泛存在于多种动物体内。在人及哺乳动物体内，主要存在于甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺组织中，鱼类则在鲑、鳗、鳟等的终鳃体里含量较多。已从人、牛、猪的甲状腺和鲑、鳗终鳃中分离出纯品。各种不同动物来源的降钙素，氨基酸排列顺序有些差异，由鲑鱼中获得的降钙素对人的降钙作用比从其他哺乳动物中分离出的降钙素要高25~50倍。
（2）工艺过程
猪甲状腺经绞碎，用丙酮脱脂制成甲状腺丙酮粉27kg，加入0.1mol/L盐酸1540L，加热至60℃搅拌1h，加水1620L混匀，搅拌1h，离心。沉淀用水洗涤，合并上清液和洗液再搅拌2h后离心。收集上清液，加入15L异戊醇：醋酸：水（20∶32∶48）的混合液搅匀，加热至50℃，用硅藻土作助滤剂过滤，收集沉淀。沉淀溶于0.3mol/L氯化钠液8L中，用10％盐酸调节pH为2.5，离心除去不溶物，收集离心液。溶液用10倍水稀释后，通过CMC（5×50cm）柱，柱用0.02mol/L醋酸缓冲液（pH4.5）平衡，收集含有降钙素的溶液，冻干或用2mo1/L的氯化钠盐析制得降钙素粉末，在此基础上还可进一步纯化。
【知识拓展】
丙酮粉
组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中，如鸽肝乙酰化酶就用此法。
常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于0.01mol/LpH6.5的磷酸缓冲液中，在0℃下一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的—15℃无水丙酮内，10min后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。
3.2.3基因重组法
由于天然动植物中的有效成分含量低，杂质太多，一般天然终产品得率不高、纯度较低。此外，大部分蛋白质具有种属特异性，如猪生长素作用于人体不起作用，而猪胰岛素作为一种异源蛋白作用于人体有抗原性，用的次数多了，会降低治疗效果。
基因工程技术使得很多从自然界很难或不能获得的蛋白质得以大规模合成。80年代以来，以大肠杆菌作为宿主，表达真核cDNA和病毒抗原基因等，为人类获取大量有医用价值的多肽类蛋白质开辟了一条新的途径。
3.2.3.1利用基因工程菌（细胞）
把人体细胞内含有的合成某一多肽或蛋白质的基因分离出来，再结合一定的载体，转入特定的受体细胞，通过受体细胞将该多肽或蛋白的基因表达出来。目前采用的受体细胞有大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等，该方法产量高、成本低，已有胰岛素、生长素等多种多肽蛋白质药物采用该方法生产。
3.2.3.2利用转基因动物
将药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质基因的调节元件下游，将连接产物显微注射到受精卵或胚胎干细胞，转基因胚胎长成个体后，在泌乳期可以源源不断地提供目的基因的产物（药物蛋白质）。该方法不仅产量高，而且表达的产物已经过充分修饰和加工，具有稳定的生物活性。作为生物反应器的转基因动物又可无限繁殖，故具有成本低、周期短和效益好的优点。
目前，多种由转基因家畜乳汁中分离的药物蛋白正用于临床试验。2009年2月，美国食品药品管理局首次批准了用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物Atryn上市，治疗一种被称为遗传性抗凝血酶缺乏症的疾病。这种新药的推出，有望拉开用转基因动物作为药物工厂的序幕。
3.2.3.3重组胰岛素生产举例
胰岛素是由动物胰腺的胰岛β细胞分泌的一种蛋白类激素，是治疗Ⅰ型糖尿病最有效的药物。胰岛素是由两个二硫键连接的A链和B链共51个氨基酸残基组成，A链由21个氨基酸残基组成，链内有一个二硫键；B链由30个氨基酸残基组成，链间有两个二硫键。
【知识拓展】
糖尿病基本分为四类，包括：Ⅰ型（胰岛素依赖型）、Ⅱ型（非胰岛素依赖型）、其他型和妊娠糖尿病。Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的病因不太清楚，我们称之为原发性糖尿病；其他型糖尿病多有其特殊的病因可查，如胰腺疾病造成的胰岛素合成障碍，或同时服用了能升高血糖的药物；妊娠糖尿病是妇女在妊娠期间诊断出来的一类特有的糖尿病。Ⅰ型糖尿病及Ⅱ型药物控制效果不好的患者必须服用胰岛素。
在1982年以前，人类应用的全部是动物来源的胰岛素，随着1982年世界上第一个重组药物人胰岛素的问世，动物胰岛素就逐渐被基因工程人胰岛素所取代。目前重组人胰岛素的生产中应用的有两种宿主表达系统，即大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
【知识拓展】
胰岛素药品研制历史
早期使用的胰岛素制剂和胰岛素粗提物差不多，由于杂质的原因，其治疗价值受到限制，经常注射则不良反应加剧。粗提沉淀步骤的引入产生了中等纯度的胰岛素制剂，部分降低了副作用的范围和严重程度。1923年分离纯化的动物胰岛素问世，1926年首次得到胰岛素结晶，大约10年后，认识到锌的存在能加速结晶。结晶胰岛素通常还经过重结晶进一步提高产品的纯度，这种制剂称为传统胰岛素。
20世纪70年代，人们应用酶法和化学法将猪胰岛素转变为与人胰岛素氨基酸序列相同的胰岛素，首次解决了动物胰岛素对人体的免疫原性问题。
1982年，美国等国家首先批准重组人胰岛素（在化学结构和功能上与天然人胰岛素相同）用于临床治疗，目前美国、丹麦、中国等多个国家能生产重组人胰岛素。科学家们又在用DNA重组技术进行胰岛素结构的修饰，以提高胰岛素药物的半衰期及作用效果。
胰岛素用药量大，糖尿病病人一般必须每天使用几毫克胰岛素以维持生命，且用药时间长，胰岛素依赖型糖尿病患者一般都是终身使用，因此对胰岛素纯度要求很高，经过多次重结晶的胰岛素仍含有少量杂质，怎样提高胰岛素的纯度，贯穿了胰岛素药品研制的始终。
（1）大肠杆菌表达胰岛素原法
早期生产多采用这种方法，分别用大肠杆菌表达胰岛素的A链和B链，纯化后，在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。美国EliLilly公司采用该法生产的重组人胰岛素Humulin最早获准商品化。用大肠杆菌表达胰岛素两个优点：一是表达量高，一般表达产物可以达到大肠杆菌总蛋白质的20％~30％；二是表达产物为不溶解的包涵体，所以经过水洗后表达产物的纯度就可达到90％左右，因而易于下游纯化。其缺点是表达出的胰岛素尚没有生物活性，需要复性。
（2）酵母菌表达胰岛素原法
目前多运用酵母菌表达胰岛素原法生产重组胰岛素。用酵母表达人胰岛素也具有两个优点：表达产物二硫键的结构与位置正确；不需要复性加工处理。其缺点是表达量低，发酵时间长。
酵母表达体系由以下几个部分组成：信号肽、前肽序列、蛋白酶切位点和微小胰岛素原。前肽序列的作用是引导新合成的微小胰岛素原通过正确的分泌途径，即从细胞内质网膜到高尔基体，随后分泌至细胞外。在分泌过程中微小胰岛素原形成结构正确的二硫键，然后由酵母细胞内的一种特殊蛋白酶在KR（赖氨酸—精氨酸）酶切位点将前体肽链切除，最后有正确构象的微小胰岛素原分泌至细胞外。
微小胰岛素原是胰岛素A、B链的融合蛋白，连接A、B链的多肽比天然胰岛素原C肽短。发酵结束后离心去除酵母细胞，培养液经超滤澄清并浓缩，以离子交换柱吸附和沉淀法去掉大分子杂质，得到纯化的微小胰岛素原。用胰蛋白和羧肽酶处理，得到胰岛素粗品。
再通过离子交换色谱、分子筛色谱、两次反相色谱去除连接肽和有关降解杂质，获得胰岛素纯品。重结晶后得到的终产品纯度达97％以上。
【合作讨论】
课前讨论
1.什么是激素？什么是细胞因子？你知道的有哪些？
2.是不是所有糖尿病患者都必须使用胰岛素？胰岛素的给药形式有哪些？
3.儿童和老人一般都需补钙，为什么还有降钙素药物？
4.请介绍一下糖尿病及其治疗。
课后讨论
1.介绍一种多肽或蛋白质激素的生产方法、利用现状及发展前景。
2.介绍一种细胞因子的生产方法、利用现状及发展前景。
【复习思考题】
1.多肽蛋白质类药物可分为哪几大类？
2.多肽蛋白质类药物生产方法有哪几种？
3.为什么用大肠杆菌生产重组胰岛素时，要破碎细胞，而用酵母生产时，不用破碎细胞呢？
4.利用形状与相对分子质量大小不同、等电点不同、溶解度不同、专一性不同纯化蛋白质的技术分别有哪些？
5.重组DNA技术制造人胰岛素的两种途径。
6.降钙素的生产工艺过程及控制要点。
