细菌破碎后，由于核酸的释放，在260nm处将有明显的光吸收增加。破碎不完全，将直接影响包涵体的纯度和rIL‐2的收率。
②包涵体的制备和溶解
细菌破碎后，离心收集沉淀，制得粗制包涵体。与包涵体一起沉淀的有可溶性杂蛋白、脂质、细菌外膜蛋白、核酸、肽聚糖和脂多糖等，用TE缓冲液反复洗涤以除去可溶性蛋白和核酸。在包涵体溶解前，为使其杂质含量降至最低，加入4mol/l的尿素（低浓度的变性剂），在室温下磁力搅拌30min，溶解脂质和外膜蛋白，离心收集沉淀，制得较纯包涵体。
制备的rIL‐2包涵体需在高浓度变性剂条件下溶解，常用的变性剂是盐酸胍、SDS和尿素等。对溶解液离心收集上清，制得rIL‐2粗提液。通常在变性剂溶解rIL‐2包涵体时加入10mmol/LDTT。DTT的作用是保持rIL‐2处于还原状态，避免氧化。还原型rIL‐2的‐SH极易被空气氧化，而在高浓度变性剂和高浓度蛋白条件下，容易形成分子间二硫键。
③rIL‐2粗提液的纯化
虽然在洗涤和溶解包涵体前，杂质已被大量除去，但要获得高纯度的重组rIL‐2，仍需对rIL‐2粗提液进行纯化。将rIL‐2粗提液先后上SephacylS—200和SephacylS—100层析柱，洗脱后，收集蛋白峰。
此步骤主要是除去多聚体和内毒素，在接近生理环境的缓冲液内，内毒素多为高的相对分子质量聚合物，脂膜或脂囊。因为接近重组蛋白分子质量的内毒素属极少数，所以凝胶过滤层析根据分子质量的大小进行分离，内毒素和聚合体先于目的蛋白被洗脱下来，达到分离的目的，因而凝胶过滤是最合适的简单直接的去热原方法。
④还原型rIL‐2的氧化复性
将收集的蛋白峰上G‐25凝胶柱脱盐去除DTT还原剂，收蛋白样品。加入硫酸铜，室温氧化复性，再加入一定浓度的EDTA，中和多余的铜离子，4℃保存。
⑤反相高效液相纯化rIL‐2
具有生物活性的rIL‐2样品用三氟醋酸和乙腈调pH至2~3，上到已经平衡好的C4和C8柱中，用含0.1％三氟醋酸的水和乙腈进行梯度洗脱，乙腈浓度变化从40％~64％。收集rIL‐2活性蛋白峰。通过反相色谱可以去除部分折叠、不完全和错误折叠的部分。然后将纯化的样品倒入旋转减压蒸发仪球形瓶中，在真空0.09MPa下温度40℃，进行低温蒸发，当感觉球形瓶中样品发稠时即可，加入适量水溶液溶解，即为rIL‐2原液。
13.7.2干扰素
干扰素（IFN）指脊椎动物细胞受干扰素诱生剂作用后，合成的具有广谱抗病毒活性的蛋白质。是一组多功能的细胞因子，可干扰病毒的复制。按结构和来源不同，干扰素可分为α、β、γ三型。干扰素α来源于白细胞。干扰素β与干扰素α有25％~30％的同源性，来源于成纤维细胞。干扰素γ与干扰素α、干扰素β无同源性，来源于T细胞。按氨基酸序列和组成的差异，干扰素α又分25个以上亚型（干扰素α1、α2、α3……），同一亚型又可按个别氨基酸差异进行细分，如干扰素α2a、α2b、α2c等。干扰素β有4个亚型。干扰素γ有4个以上亚型。
干扰素的生物功能活性可归纳为：①抗细胞内侵害微生物活性；②抗细胞分裂活性；③调节免疫功能活性。干扰素α在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病，如毛细胞白血病、淋巴瘤、实体瘤、病毒引起的慢性肝炎、乳头瘤病毒引起的尖锐湿疣、呼吸道病毒感染等；干扰素β治疗多发性硬化症，已经获得美国FDA的批准；干扰素γ的免疫调节作用使其在治疗类风湿关节炎方面取得了良好的效果。
1980年，利用基因工程成功地获得了IFNα及IFNβ的cDNA，目前编码干扰素的基因已能在大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞中得到表达。α、β、γ三型基因工程干扰素都已研制成功，产品已投放市场，用于治疗的病种已达20多种。我国卫生部已批准生产的干扰素品种有IFNα‐1b、IFNα‐2a、IFNα‐2b和IFNγ四种。目前，人们已经在利用蛋白质工程技术研制活性更高、更适用于临床应用的干扰素类似物和干扰素杂合体等各种新型干扰素。
13.7.3促红细胞生长素
促红细胞生长素（EPO）主要由肾脏产生，也可由肝细胞、巨噬细胞等产生。在生理情况下，它能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟，维持外周血的正常红细胞水平，防止肾功能衰竭导致的贫血。
促红细胞生长素是治疗肾功能衰竭导致贫血的首选药物，亦可治疗一些非肾性原因导致的贫血，如慢性感染、炎症和手术等，还可明显减少化疗后的输血量和减轻贫血。
人促红细胞生成素是由193个氨基酸组成的高度糖基化的蛋白质，其中27个氨基酸为信号肽，成熟蛋白质由163个氨基酸组成。糖基对于促红细胞生长素的生物活性至关重要，重组促红细胞生长素不能利用大肠杆菌表达，只能利用哺乳动物表达系统。
1985年美国有两家公司同时报道了人促红细胞生长素基因的克隆，1991年美国FDA正式批准重组人促红细胞生成素（rhEPO）上市，成为在临床上治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血的最畅销新药，也是目前最成功的重组细胞因子药物之一。我国的rhEPO于1995年开始进行临床验证，目前已有7家以上的单位获准生产。国外的rhEPO市场是基因药品最大的市场，而国内由于消费水平的影响，市场尚处于发展阶段。
13.7.4集落刺激因子
集落刺激因子（CSF）是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子，故又称造血刺激因子或造血生长因子。现在已知的CSF主要有4种：①粒细胞集落刺激因子（G‐CSF）；②巨嗜细胞集落刺激因子（M‐CSF）；③粒细胞‐巨嗜细胞集落刺激因子（GM‐CSF）；④多能集落刺激因子（Nulti‐CSF，即IL‐3）。CSF的功能可概括为刺激造血细胞增殖、维系细胞存活、分化定型等。CSF在临床上多用作癌化疗的辅助药物，如化疗后产生的中性白细胞减少症，也用于骨髓移植促进生血作用，还可用于治疗白血病、粒细胞缺乏症、再生障碍贫血等多种疾病。
各类CSF的基因结构及其功能早已研究清楚，并在各种宿主细胞中成功表达，1991年美国FDA批准G‐CSF和GM‐CSF作为新药投入市场。我国研制的GM‐CSF和G‐CSF也已被批准上市。
13.7.5肿瘤坏死因子
肿瘤坏死因子（TNF）这一名称是因最初发现时观察到它的抗肿瘤活性而命名的。随着人们对TNF的深入研究，该名称已不再能反映其全部的生物活性。TNF除具有抗肿瘤活性外，对多种正常细胞还具有广泛的免疫生物学活性，如炎症活性，促凝血活性，促进细胞因子分泌，免疫调节作用，抗病毒、细菌和真菌作用等。
1984年重组TNF获得成功后，1985年即获美国FDA批准用于临床，在治疗某些恶性肿瘤上收到较好的效果。但天然TNF有一定毒副反应，现着重用蛋白质工程技术研制TNF突变体，以提高比活性和减少毒副作用。如原型TNF分子中第80、90和92位的Ile、Lys和Asn分别被Ser、His和Val置换，经E.coli表达产生rhTNFαD3a产物，毒性比原型TNF低11倍左右。
13.7.6组织型纤溶酶原激活剂
组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤溶酶，纤溶酶水解血凝块中的纤维蛋白网，导致血栓溶解，主要用于治疗血栓性疾病。由于tPA只特异性地激活血栓块中的纤溶酶原，是血栓块专一性纤维蛋白溶解剂，对人体无抗原性，故它是一种较好的治疗血栓疾病物。
重组tPA已于1987年由美国FDA批准作为治疗急性心肌梗塞药物投放市场，1990年FDA又批准用于治疗急性肺栓塞。为了延长tPA在体内的半衰期和进一步提高tPA的效力，应用蛋白质工程技术已经研究开发出第2代新型γtPA。如通过将tPA分子中EGF功能域上的Cys改换为Ser而获得的tPA突变体，半衰期由原来的6min延长到20min；又获得另一种单链、无糖基化的tPA缺失突变体，其溶纤能力约是原tPA的25倍，而血浆清除率较tPA减慢了77％。
除上述介绍的几种主要基因工程细胞因子外，还有抗血友病因子、凝血因子VⅡ、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等。不过，销路最好的还是干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素及肿瘤坏死因子等细胞因子。另外，一大批新型的细胞因子药物正处在不同的研究阶段并不断涌现出来。
【合作讨论】
课前讨论
1.细胞因子有哪些？用途是什么？
2.细胞因子在人类健康方面发挥着怎样的作用？
3.能用动物的干扰素或白细胞介素治疗人类疾病吗？
4.简述细胞因子的研究历程。
课后讨论
1.简述重组干扰素‐α的制备工艺及原理。
2.简述一种集落刺激因子的制备工艺及原理。
3.重组细胞因子的发展前景如何？
4.简述重组肿瘤坏死因子的制备工艺及原理。
5.简述重组干扰素‐α的制备工艺及原理。
6.简述碱性成纤维细胞生长因子。
7.简述细胞因子的研究前景。
【复习思考题】
1.DNA重组药物主要有哪几类？举例说明。
2.试叙述基因工程药物的一般制备过程。
3.基因工程技术中，目的基因的获得有哪些方法？
4.表达载体的一般要求是什么？
5.什么是包涵体？包涵体具有什么特点？
6.常用的基因工程宿主有哪些？各有什么特点？
7.简述获得目的基因的方法。
8.简述提高目的基因在大肠杆菌中表达的措施。
