知识目标
掌握多抗、单抗和基因工程抗体的概念、应用及优缺点；
掌握多抗和单抗的制备方法，了解基因工程抗体的制备方法；
了解基因工程抗体的种类及各自的优势。
能力目标
具备从事抗体生产及相关工作的能力；
培养学生的无菌操作意识、自学能力、分析问题能力；
培养学生的团结协作精神。
抗体作为药物用于人类疾病的治疗拥有很长历史。1891年，德国医学家贝林首次用白喉抗毒素治疗了柏林诊所一个儿童患者，使之死里逃生，这一发现使人类首次认识了抗体的重要性，也拉开了抗体研究与发展的历史。至今，以破伤风抗毒素血清为首的抗体制剂仍是紧急预防和治疗某些疾病的有力武器。
但整个抗体药物的发展并非一帆风顺。第一代抗体药物源于动物多价抗血清，主要用于一些细菌感染性疾病的早期被动免疫治疗。虽然第一代抗体药物具有一定的疗效，但由于异源性蛋白的存在，易引起较强的人体免疫反应，限制了这类药物的应用，逐渐被抗生素类药物所代替。
1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein等人首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体，即第二代抗体药物。单克隆抗体具有纯度高、特异性强、可以提高检测的敏感性及特异性、可大量生产等特点，为抗体的制备和应用提供了全新的手段。
单抗最早被用于疾病治疗是在1982年，美国斯坦福医学中心Ley等人利用制备的抗独特型单抗治疗B细胞淋巴瘤，治疗后患者病情缓解，瘤体消失，这使人们对抗体药物产生了极大的期望。1986年，美国FDA批准了世界上第一个单抗治疗性药物———抗CD3单抗OKT3进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应，此时单克隆抗体的研制和应用达到了顶点。随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，鼠单抗用于人体的毒副作用也越来越明显，同时因其相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，一些抗肿瘤单抗未能显示出理想效果，人们的热情开始下降。80年代末至90年代初，单克隆抗体研究进入低谷。
近年来，随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始用于抗体的改造，人们可以根据需要对鼠抗体进行相应的改造以消除抗体的不利性状或增加新的生物学功能。抗体药物的研发进入了第三代，即基因工程抗体时代。
自从1984年第一个基因工程抗体人—鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体（Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫黏连素）等。各种形式基因工程抗体的成功制备和应用将抗体药物的研制带入一个快速发展的新时期。到目前为止，美国FDA已经批准了16个抗体治疗药物，其中12个均为基因工程抗体。
10.1多克隆抗体
10.1.1多克隆抗体的概念
大多数抗原（如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等）是由大分子蛋白质组成的，往往具有多种不同的抗原决定簇。在机体淋巴组织内存在着千百种抗体形成细胞（即B细胞），每种抗体形成细胞只识别其相应的抗原决定簇，受抗原刺激后可增殖分化为一种细胞群，这种由单一细胞增殖形成的细胞群体可称之为细胞克隆。
当一种天然抗原经各种途径免疫动物时，就可刺激机体产生多种细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，然后分泌到血清或体液中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，即多抗，这也是第一代抗体。自19世纪末用免疫动物获得抗血清以来，这种途径一直是获得抗体的经典方法。
10.1.2免疫血清与多抗的制备
一般来说，制备多克隆抗体相对简单，操作不算复杂，但是，欲获得特异性好、亲和力高的多克隆抗体常常并不容易，需考虑抗原的制备、免疫动物的选择、佐剂的应用、免疫途径和免疫程序、抗体的纯化等众多因素。
10.1.2.1动物的选择和管理
用于制备免疫血清的动物可以是同种或异种动物，一般制备抗菌血清和抗毒素多用异种动物，而抗病毒血清多用同种动物。总的来看，制备免疫血清比较常用的动物为马，因其血清渗出多、外观较好。
用于制备免疫血清的动物必须健康，来自非疫区，使用前应经必要的检疫。如有可能，最好自繁自养动物或购SPF动物及其他级别的动物。动物以体形较大，性情温驯，体质强健的青壮年动物为宜。由于动物存在个体免疫应答的差异，所以选定的动物要有一定的数量，不能只用一只。
作为免疫用的动物应由专人负责管理和喂养，饲料要营养丰富多汁，动物要适当运动，并保持清洁，随时观察动物状态，如有异常，及时治疗处理。
10.1.2.2免疫原
免疫原的免疫原性与制备的血清的质量和数量密切相关。要根据病原微生物的培养特性，采用不同的方法制备。
制备抗菌血清时，基础免疫多为疫苗或死菌苗，高度免疫时一般选择毒力较强的菌株。有时要用多品系、多血清型菌株。用最适生长的培养基按常规方法进行培养，在生长菌数高峰期（多为16~18h的培养物）收获新鲜菌液，经纯菌检验合格后即可作为免疫原。
抗病毒血清制备时，基础免疫用弱毒疫苗，高度免疫可用强毒菌株。
抗毒素血清的免疫原可用类毒素、毒素或全培养物，但一般用类毒素作免疫原。
10.1.2.3免疫程序
分为基础免疫和高度免疫两个阶段。
基础免疫用疫苗按预防剂量作第一次免疫，7d或2~3周左右，用较大剂量疫苗或特制灭活抗原再免疫1~2次，即完成基础免疫。基础免疫抗原无须过多过强，否则会导致免疫耐受。
高度免疫在基础免疫2周左右进行，也有人认为至少应一个月左右。采用强毒抗原（一般毒力越强，抗原性越强），免疫剂量逐渐增加，间隔3~10d，次数视血清抗体水平而定，1~10次不等。
免疫途径一般采用皮下或肌肉注射。应采用多部位注射，每一注射点的抗原量不宜过多，油佐剂抗原更应注意。
10.1.2.4血液的采集
按照免疫程序完成免疫的动物，经检验血清抗体效价达到合格标准时，即可采血；不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者淘汰。一般血清抗体的效价高峰出现在最后一次免疫后的7~10d。采血可用全放血或部分采血，采用全放血法时，放血前应禁食24h，但应饮水，以防血脂过高。采血须无菌操作。
10.1.2.5血清的制备
少量血清制取时，可将全血注入灭菌容器内，然后先于37℃静置2h，之后置4℃冰箱，次日离心收集血清。如采集血量较大时，可将动物血直接收集于事先用灭菌生理盐水或PBS液润洗的玻璃筒内，置室温自然凝固，约2~4h后，当有血清析出时，每采血筒内加入灭菌不锈钢砣，经24h后，用虹吸法将血清吸入灭菌瓶中，加入防腐剂。放置数日作无菌检验，合格后分装，保存于2~15℃半成品库，经抽样检验合格后交成品库保存出厂。
10.1.2.6多克隆抗体的制备
如果希望做一些纯化，可用饱和（NH4）2SO4溶液盐析，除去杂蛋白，再透析脱盐。如需进一步纯化可用层析方法。
10.1.3多抗的应用
尽管目前在生物医药领域的应用中，多数多克隆抗体已被单克隆抗体所代替，但是由于多克隆抗体通常具有很高的亲和力，制备过程相对简单，在特殊情况下，利用免疫血清治疗仍具有单克隆抗体无法替代的优势，因此还存在较大的空间。如利用抗蛇毒血清治疗毒蛇咬伤，预防或治疗狂犬病、破伤风、肉毒中毒等多种疾病。
但是，用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且这种抗体是不均一的，注入人体具有产生超敏、过敏、传播感染性病原体（包括朊病毒等）的危险，无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制。
【知识拓展】
免疫血清使用的注意事项
1.尽早使用 因为抗体只能中和未结合细胞的毒素和病毒，而对已侵入细胞的毒素和病毒无效，故越早使用，效果越好。
2.足量多次 抗体在机体内会逐渐衰减，免疫力维持时间较短，足量多次使用才能保证效果。
3.防止过敏反应的发生异种动物制备的免疫血清使用时可能会引起超敏反应，应备好抢救措施。
10.2单克隆抗体
当一种天然抗原经各种途径免疫动物时，不同的抗原决定簇就会刺激相应的抗体形成细胞增殖分化为细胞克隆。同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记以及生物学特性等方面都是完全相同的均一性抗体，亦可称之为单克隆抗体（McAb）。
单克隆抗体与多克隆抗体的比较。
单克隆抗体理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，可以克服很多多克隆抗体的缺点。但由于从免疫血清中分离单克隆抗体难以实现，单克隆抗体的制备一直是摆在科学家面前的难题，直到1975年德国学者Kǒhler和英国学者Milstein等人创立了杂交瘤技术。
10.2.1杂交瘤技术的原理
杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，即成为能够分泌抗体并能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过克隆化后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。
10.2.1.1亲本细胞的选择与融合
（1）免疫脾细胞
融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的能分泌特异性抗体的B细胞，通常来源于免疫动物的脾脏。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
（2）骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤，具有在体外长期增殖的特性并且和B淋巴细胞融合率较高。用于杂交瘤技术的骨髓瘤细胞应具备如下要求：①选择有次黄嘌呤—鸟嘌呤核苷酸转换酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷的细胞株，此种骨髓瘤细胞不能在选择培养基中生长；②细胞能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，并分泌免疫球蛋白；③骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白。目前常用的骨髓瘤细胞主要有NS1细胞株和SP2/0细胞株。
（3）细胞融合
细胞融合的方法很多，如仙台病毒诱导融合、PEG诱导融合和电冲击融合法。目前仍以小分子PEG（分子量为1000的PEG）最常用，其浓度在30％~50％之间。
10.2.1.2选择性培养
将致敏B淋巴细胞与有代谢缺陷的骨髓瘤细胞进行细胞融合，这种融合是随机的，除骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成杂交瘤细胞外，还有骨髓瘤细胞之间和脾细胞之间的融合，以及一些未融合的细胞。这些细胞中，只有杂交瘤细胞能够在HAT培养基中存活，从而将杂交瘤细胞分离出来。
（1）HAT培养基
HAT培养基是一种选择培养基，其中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶（T），它是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞的特殊培养液。
（2）选择性培养基的作用原理
细胞DNA的合成有两条途径：一条是生物合成的主要途径，即由氨基酸及其小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA。在这一合成途径中，叶酸作为重要的辅酶。另一途径为辅助途径，以次黄嘌呤和胸腺嘧啶为原料，在次黄嘌呤—鸟嘌呤核苷酸转换酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化作用下合成DNA。HAT培养基中含有氨基蝶呤（为叶酸拮抗剂），故所有细胞的DNA主要合成途径均被阻断，只能通过辅助进行DNA的合成。
HGPRT缺陷型或TK缺陷型的骨髓瘤细胞在HAT培养基中因不能通过辅助途径合成DNA而死亡。脾细跑虽有HGPRT或TK，但不能在体外长期培养繁殖，一般在2周内死亡。而杂交瘤细胞因从脾细胞获得HGPRT或TK，可通过辅助途径合成DNA，同时又具备肿瘤细胞的特点，可以在体外长期增殖。
10.2.1.3克隆化与阳性孔筛选
由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的克隆化，二是在此基础上进行阳性单克隆筛选。
（1）克隆化
将混合细胞分离成独立的单个细胞，再扩大培养形成克隆，方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。
有限稀释法是最常用的方法，通过充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数为1个细胞。方法为：1）取出阳性孔内的细胞进行计数；2）用培养液将其稀释到例如每毫升内10个细胞；3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，其几率将是每孔内落入一个细胞；4）加入一定数量的饲养细胞，经过2~3天后，可观察到有集落生长的孔，并标记单克隆。
