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第37章 附录2 常用显微化学鉴定及试剂的配制

(一)碘—硫酸法

植物细胞的细胞壁的主要成分是纤维素,纤维素由于硫酸和碘的作用,呈蓝色反应。

方法是将1%碘液滴于要测定的材料上,然后加一滴66.5%硫酸。纤维素被硫酸水解后,遇碘则呈蓝色反应。已木质化的细胞壁,因木质素的掩盖,不能与纤维素发生作用,因此细胞壁不呈蓝色反应。

试剂配制方法:

1%碘液:将1.5 g碘化钾溶于100 mL的蒸馏水中,待完全溶解后,加入1 g碘,振荡溶解。66.5%硫酸:7份浓硫酸加入3份蒸馏水配制而成。配制时要使浓硫酸慢慢地加入水中,并不断地用玻璃棒搅拌,否则会因急剧发热而使容器炸裂。

(二)苏丹 Ⅲ反应

苏丹 Ⅲ可将细胞中脂肪、栓质、角质染为橘红色。因此,可用此染料显示上述物质在细胞中的分布和位置。其配制方法是:将苏丹 Ⅲ(或苏丹 Ⅳ)染料0.1 g,溶于10 mL 95%酒精中,然后加入10 mL甘油。

(三)间苯三酚反应法

间苯三酚的反应是植物显微化学中确定木质化细胞壁的最常用和最简单的方法。这一反应是当间苯三酚与细胞壁中木质素相遇时,发生樱桃红色或紫红色反应。其方法是所要鉴定的切片先用一滴1 mol/L盐酸浸透(间苯三酚要在酸性环境下才能与木质素起作用),然后滴一滴5%~10%间苯三酚的95%酒精溶液,木质化的细胞壁即发生颜色反应。

(四)碘液测试淀粉法

淀粉遇碘呈蓝色反应,它是测定淀粉的最常用方法。碘液配制方法是:2 g碘化钾放入5 mL蒸馏水中,加热使其完全溶解。然后加入1 g碘,完全溶解后用蒸馏水稀释至300 mL,放入具有毛玻璃塞的棕色玻璃瓶中,置于暗处保存。

测定淀粉时,可将上述溶液稀释2~10倍,这样染色不致过深,效果更好。

(五)压片法常用的染料

1.醋酸洋红

为压片法中最常用的染料。配制方法是:先将100 mL 45%醋酸水溶液于烧瓶中煮沸,移去火焰,停止加热。然后缓慢加入1 g洋红粉末,全部加入后再煮沸1~2分钟。此时可将一枚生锈铁钉用棉线悬入溶液中约1分钟后取出(铁为媒染剂)。静置12小时后经过过滤,放入磨口玻璃塞棕色瓶中保存备用。

2.石炭酸—品红

为近年创用的一种优良核染色剂,将细胞核和染色体染为红紫色,胞质一般不着色,背景清晰。其配制方法有二:

配方Ⅰ:

原液A:取3 g碱性品红溶于100 mL的70%酒精中(此液体可长期保存)。

原液B:取10 mL原液A,加入90 mL的5%的石炭酸(酚)水溶液中(可保存两周)。

染色液:取55 mL原液B加6 mL冰醋酸和6 mL的37%甲醛。

此染色液因含有较多的甲醛,可使原生质体硬化,而能保持其固有的形态。但也因此不易使组织软化,因而不太适用于植物组织的染色体压片染色(本染色液适于植物原生质体培养中使用)。在此基础上加以改进的配方 Ⅱ,则可普遍地用于一般植物组织的染色体压片的染色。

配方 Ⅱ:

取配方Ⅰ中的染色液20 mL加80 mL 45%醋酸和1.8 g山梨醇。

染色液配制后为淡品红色,如立即使用染色较浅。放置2周后,染色能力显著增强,而且放置时间越久,染色效果越好。

(六)铬酸—硝酸离析法

为了观察一个细胞完整的立体形态结构,可以用一些化学药品把细胞壁中的中层物质(果胶质)溶解,使细胞分离散开,便于观察。离析前先把材料洗净,用刀切成1~2 mm宽的狭条(如叶片)或切成火柴棍粗细的长约1 cm小条(如根或茎)。当然也要考虑观察的对象,如要观察木质部的组成分子,则可把根或茎的外面树皮剥去,再切成小条。切好后的材料放进小玻璃瓶中,然后加入离析液,加入量约为材料的20倍。塞紧瓶塞,放于30℃~40℃温箱中。浸渍时间因材料性质而异,一些叶片或幼嫩的根和茎组织,3~4小时即可,而有些次生结构(如木质部)则需要更长的时间,离析情况应随时检查。检查的方法是取少许离析材料,放在载玻片上,加一滴水,加上盖玻片。然后用解剖针尖端轻轻敲打,如果材料分离则表明浸渍时间已够。浸渍时间超过一天以上时,应更换离析液一次。离析时间已够的材料,用水洗净后放入50%或70%酒精中保存。

离析液配方:

10%铬酸1份,10%硝酸1份,两种溶液应在使用时才混合,混合均匀后再使用。

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