实验目的
（1）了解基因组DNA的提取原理。
（2）掌握乳酸菌基因组的提取方法。
实验原理
乳酸菌是革兰氏阳性菌，细胞壁比较厚，因此本实验中利用溶菌酶和SDS破壁。然后利用酚/氯仿/异戊醇反复抽提蛋白质碎片等杂质，经异丙醇沉淀DNA、乙醇洗涤DNA，得到较高纯度的基因组DNA。
实验材料
（一）菌种
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。
（二）培养基
M17液体培养基（培养基15）。
（三）试剂
（1）TE缓冲液（1L）10mmolTris？HCl、1mmolEDTA，pH8.0，121℃、20min灭菌备用。
（2）0.5mo1/L EDTA EDTA186.1g溶于800mL双蒸水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，121℃、20min灭菌备用。
（3）200g/L SDS SDS200g溶于900mL双蒸水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH至7.2，定容至1000mL。
（4）TES缓冲液（1L）50mmolTris？HCl缓冲液，1mmolEDTA，质量分数为6.7%的蔗糖，pH8.0.
（5）RNaseA、溶菌酶、酚/氯仿/异戊醇（25：24□1，体积比）、异丙醇、70%乙醇。
（四）仪器及其他用品
恒温培养箱、紫外分光光度计、恒温水浴锅、高速离心机、微量移液器、1.5mL离心管。
实验流程
菌种培养→收集菌体细胞→菌体裂解→酚/氯仿/异戊醇抽提蛋白→DNA沉淀，溶解
实验步骤
（一）菌种培养
挑取乳酸菌菌落到装有5mL M17液体培养基的试管中，37℃培养至OD600值2.0～2.5.
（二）菌体细胞的收集
取1.5mL培养好的菌液于1.5mL离心管中，6000r/min离心1min，弃上清液，收集菌体细胞。用ddH2O或者TE缓冲液漂洗菌体细胞两次，然后将菌体细胞重新悬于500μL的TES缓冲液中。
（三）菌体细胞的裂解
将每管菌液加入10mg的溶菌酶，混合均匀后37℃裂解30min，再加入125μL 200g/L的SDS，混合均匀后37℃裂解15min。
（四）酚/氯仿/异戊醇抽提
在每管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24□1，体积比），充分混匀后，4℃下12000r/min离心10min，将上清液转入新的离心管中，重复抽提3次。
（五）DNA的获得
将上清液中加入约0.8体积的异丙醇，-20℃放置60min，以充分沉淀DNA。然后，15000r/min离心5min，弃去上清液（注：该操作一定要细心）。将Ep管中加入1mL体积分数是70%的乙醇洗涤沉淀，15000r/min离心5min后，小心弃去上清液后自然干燥。用100μL TE缓冲液溶解DNA，并加入适量RNaseA，-20℃冰箱放置备用。
实验结果与报告
（一）DNA定量
DNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中到230nm处。因此，可以用260nm波长测定DNA的浓度，OD260=1相当于大约50μg/mL双链DNA。如用1cm光径，用H2O稀释DNA样品n倍后并以H2O为空白对照，根据此时读出的值即可计算出样品稀释前的浓度：
DNA（mg/mL）=50×OD260×稀释倍数/1000
DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280值可以估计DNA的纯度。若比值高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应该在0.4～0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。
（二）电泳检测
取1μg基因组DNA在1%的琼脂糖凝胶中电泳，检测DNA的完整性或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后应该出现单一的条带。
注意事项
（1）所有的用品均需要高温灭菌，以灭活残余的DNA酶。
（2）所有的试剂均用灭菌的超纯水配制。
（3）收集菌体细胞时，一定要将上清液吸净。
（4）乙醇洗涤后一定要自然干燥，去除残留的乙醇，以免影响下一步DNA的溶解。
（5）用上述方法提取的基因组DNA的纯度可以满足一般实验（如Southern杂交，PCR等）目的。如果要求更高，可参考有关资料进行DNA的纯化。
思考题
（1）为什么提取乳酸菌基因组DNA的过程中要加入足够的溶菌酶？
（2）酚/氯仿/异戊醇抽提的原理是什么？为什么要收集上清液？
（3）乙醇洗涤完毕后为什么要自然干燥？
