一、酸乳中乳酸菌的测定
实验目的
（1）了解酸乳中乳酸菌分离原理。
（2）学习并掌握发酵乳中乳酸菌菌数的检测方法。
实验原理
活性酸乳需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。
由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸乳中的各种乳酸菌可获得满意的结果。
实验材料
（一）培养基
MRS培养基（培养基14）、改良CHALMERS培养基（培养基12）、M17培养基（培养基15）。
（二）仪器及其他用品
无菌移液管（25mL，1mL）、无菌水（225mL带玻璃珠三角瓶、9mL试管）、无菌培养皿、旋涡均匀器、恒温培养箱。
实验流程
酸乳→稀释→制平板→培养→检查计数
实验步骤
（一）样品稀释
先将酸乳样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25mL加入盛有225mL无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。
（二）制平板
选用2或3个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签，分别吸取不同稀释度的稀释液1mL置于平皿内，每个稀释度做2个重复。然后用熔化冷却至46℃左右的MRS或改良CHALMERS培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。
（三）培养和计数
将平皿倒置于40℃恒温箱内培养24～48h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30～300个菌落平皿进行计算。
实验结果与报告
（一）指示剂显色反应
乳酸菌的菌落很小，直径1～3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。由于产酸，能使菌落周围的CaCO3产生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反应。
（二）镜检形态
必要时可挑取不同形态菌落制片镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。德氏乳杆菌保加利亚亚种呈杆状、单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌呈球状，成对，或短链、长链状。
（三）参照比较
MRS培养基经常用于乳杆菌的培养和选择性计数，但有报道指出改良CHALMERS培养基的检出率较MRS培养基高；M17培养基较适合于乳球菌的培养，在检测时可同时使用多个培养基作比较。
思考题
（1）为什么乳酸菌的检测关键是选用特定良好的培养基？
（2）培养基中为什么要加CaCO3？
二、发酵剂菌种活力的测定
实验目的
（1）学习测定酸乳及其发酵剂菌种活力的原理。
（2）初步掌握乳酸菌活力测定的一般方法。
实验原理
乳酸菌的细胞形态为杆状或球状，接触酶阴性，革兰氏染色阳性，耐氧或微需氧，厌氧或兼性厌氧，有复杂的营养需要，代谢方式为同型乳酸发酵或异型乳酸发酵，都能发酵葡萄糖产生乳酸，适宜在微氧或无氧条件下生长，一般在固体培养基平板上有氧条件也能生长。酸乳风味的形成与乳酸菌发酵过程中代谢产生多种物质有关，而这些物质的产生与发酵糖类产生乳酸的速度、产酸的量（能力）、还原刃天青能力等活力指标有密切关系。目前较简便的乳酸菌活力测定项目包括凝乳时间、滴定酸度、还原韧天青的时间和活菌数量等。
由于通常市售酸乳和复合菌种发酵剂中含有两种或两种以上的乳酸菌菌种，因此测定乳酸菌活力之前，需先进行平板分离和纯化培养得到纯培养物，再以制备的单一菌种扩大培养物测定其活力。如果是单一菌种发酵剂可直接测定乳酸菌活力，无需平板分离和纯化培养。
实验材料
（一）样品
市售普通活性酸乳或普通酸乳发酵剂（要求于0～4℃冰箱中保藏1周之内）。
（二）培养基
乳清琼脂培养基（培养基17）、改良MRS琼脂培养基（培养基9）、M17培养基（培养基15）、MRS液体培养基（培养基14）（5mL或10mL/试管）、脱脂乳试管培养基（培养基18）（5mL或10mL/试管，100mL/三角瓶）。
（三）试剂与染色剂
无菌生理盐水（9mL/试管，45mL/100mL三角瓶，内带玻璃珠）、0.1mol/L NaOH标准溶液、0.5%的酚酞指示剂、0.005%刃天青标准溶液、革兰氏染色液。
（四）仪器与其他用具
100mL三角瓶、带橡皮塞的无菌大试管、无菌吸管（1mL、5mL、10mL）、无菌培养皿、碱式滴定管、小三角瓶、量筒、温度计、酒精灯、接种环、蜗卷铂耳环、载玻片、无菌超净工作台、旋涡混合器、恒温培养箱、恒温水浴槽、温度计、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、电子天平、显微镜等。
实验流程
酸乳或复合菌种发酵剂→梯度稀释→平板分离→观察乳酸菌的菌落特征→纯化培养观察个体形态特征→菌种扩大培养→测定菌种的活力
实验步骤
（一）乳酸菌的分离
1.样品稀释
在无菌超净工作台内，将酸乳或发酵剂样品搅拌均匀，用无菌吸管吸取样品5mL，移入盛有45mL无菌生理盐水的三角瓶中，在旋涡混合器上充分振摇均匀，即获得10-1的样品稀释液。然后根据对样品含菌量的估计，将样品再稀释至10-2～10-7稀释度。
2.倾注法培养（平板分离）
用吸管分别吸取10-6、10-7两个稀释度的稀释液1mL各注入平皿内，倒入熔化并冷却至50℃左右的改良MRS琼脂培养基（或乳清琼脂培养基、番茄汁琼脂培养基），迅速转动平皿使之混合均匀，待凝固后倒置于40℃培养48h或37℃培养48～72h。
3.观察菌落特征
根据乳酸菌的菌落特征，对上述平板长出的菌落进行肉眼观察，必要时在低倍镜下观察（勿打开皿盖，以防污染）。
4.纯化培养
从上述不同培养基平板中分别挑取4～6个典型乳酸菌的单菌落接种于液体MRS培养基和脱脂乳试管中，置40℃温箱中培养24h，牛乳培养基试管37℃培养至乳凝固。
5.镜检形态
挑取上述试管培养物1环，进行涂片、革兰氏染色，油镜检查菌种纯度、是否为嗜热链球菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种。嗜热链球菌呈球状，成对地链状排列。德氏乳杆菌保加利亚亚种呈长短不等的杆状，单杆、双杆或长丝状。
（二）菌种扩大培养
按1%的接种量，将上述试管纯粹培养物或预制备单一菌种发酵剂的脱脂乳试管培养物接种于盛100mL灭菌脱脂乳的三角瓶中，另以同样方法分别接种具有较高活力的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌作为对照，置于40℃温箱中培养至乳凝固，一般37℃培养过夜至乳凝固后进行菌种活力测定。
（三）测定菌种的活力
1.肉眼观察
观察并记录用脱脂乳扩大培养菌种的凝乳时间。
2.酸度测定
用0.1mol/L NaOH溶液滴定发酵剂或酸乳的酸度，单位以吉尔涅尔度（。T）表示，即中和100mL样品中的总酸所消耗0.1mol/LNaOH标准溶液的体积（mL）。测定时取10mL样品，用20mL蒸馏水稀释，加入0.5%的酚酞指示剂3滴，以标定的NaOH溶液滴定（注意标定后才可使用）至微红色，以30s不褪色为终点。
3.还原刃天青能力的测定
用刃天青还原试验测定发酵剂的菌种还原刃天青所需的时间，测定流程如下：
灭菌脱脂乳9mL→加入1mL单一菌种发酵剂→加入1mL刃天青标准溶液→混匀37℃水浴→观察褪色所需时间→推知发酵剂的菌种活力
（1）取1mL发酵剂加入9mL的灭菌脱脂乳中，并加入刃天青标准溶液1mL，共置带橡皮塞的无菌大试管中，同时做不加发酵剂的对照管。
（2）将试管置于37℃水浴保温，30min后开始检查，其后每5min观察一次结果。淡粉红色为还原终点，以终点出现的时间，作为评价发酵剂菌种活力的指标。
①在35min内还原刃天青的发酵剂的活力很强。
②在50min内还原刃天青的发酵剂活力较差，但可以使用。
③50～60min还原刃天青的发酵剂活力很弱，不宜使用。
4.活菌计数
采用稀释倾注平板培养法测定乳酸菌的活菌数量。
实验结果与报告
列表记录凝乳时间、酸度、刃天青还原时间、活菌数于中，分析比较发酵剂或酸乳菌种的活力。
思考题
为什么平板分离乳酸菌之后，对菌落先进行纯化培养再进行革兰氏染色镜检？
