一、结晶
结晶是一个重要的化工单元操作，在氨基酸工业、有机酸工业、核苷酸工业、酶制剂工业和抗生素工业中有着广泛的应用，是制备纯物质的有效方法。结晶过程具有高度选择性，只有同类分子或离子才能结合成晶体，因此结晶操作能从杂质含量相当多的发酵液或溶液中析出纯净的晶体。结晶的目的就是为了获得更纯净的固体发酵产品。
（一）结晶生成基本原理
结晶是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程。晶体系化学性均一的固体，具有一定规则的晶形，以分子（或离子、原子）在空间晶格的结点上的对称排列为特征。因此，一般把许多性质相同的粒子（包括原子、离子、分子）在空间有规律地排列成的格子状的固体叫做晶体。每个格子称为晶胞，每个晶胞中所含原子或分子数，可依据测量计算求出。结晶态物质一般是固体。水合作用对结晶操作过程有很大影响，由于水合作用，物质由溶液中以具有一定晶形的晶体水合物的形式析出。晶体水合物含有一定数量的水分子，称为结晶水。谷氨酸的晶体是斜方六面体晶体，味精的晶体是带有一个结晶水的棱柱形八面体晶体。结晶的全过程包括形成过饱和溶液、晶核形成和晶体生长等三个阶段，溶液达到过饱和是结晶的前提，过饱和率是结晶的推动力。物质在结晶时放出热量，称为结晶热。结晶是一个同时有质量和热量传递的过程。溶解度与温度的关系可以用饱和曲线来表示。可以把温度-浓度图分成三个区域：稳定（不饱和）区，不会发生结晶；不稳定（过饱和）区，结晶能自发形成；介稳区，结晶不能自动进行，但如在介稳溶液中加入晶体，能诱导结晶产生，晶体能生长，这种加入的晶体称为晶种。
假设某溶液处于图中点A处，当由A冷却至C点时（溶媒量不变，直线ABC），结晶才能自动进行。另一方面，如将溶液在等温下蒸发（直线ADE），达到E点时，结晶才能自动进行。
在实际操作中，有时将冷却和蒸发合并使用。对于相同的结晶产量，在结晶过程中若晶核的形成速率大于晶体的成长速率，则产品中的晶体小而数目多。反之，产品中的晶体大而数目少。介稳区决定晶体的成长，而不稳定区决定晶核的形成。过饱和率、黏度、温度、搅拌速度、冷却速度、pH、等电点、晶种等因素均影响结晶的生成。
（二）影响晶体质量的因素
晶体质量主要是指晶体的大小、形状（均匀度）和纯度三个方面。工业生产中通常希望得到粗大且均匀的晶体。影响晶体质量的因素包括：
1.晶体的大小
晶体大小决定于晶核形成速度和晶体生长速度之间的对比关系。如晶核形成速度大大超过其生长速度，则过饱和度主要用来生成新的晶核，因而得到细小的晶体。反之，如晶体生长速度超过晶核形成速度，则得到较粗大的晶体。决定晶体大小的因素主要有过饱和度、温度、搅拌速度和杂质等。
①溶液过饱和度增加能使成核速度和晶体生长速度增快，但对前者影响较大，因此过饱和度增加，得到的晶体就较细小。实践证明，过饱和度对晶体颗粒大小的影响往往不甚显著，当过饱和度很高时才显出影响。
②当溶液快速冷却时，能达到的过饱和度较高，因而得出的晶体较细小，而且常导致生成针状结晶，这可能是由于针状较粒状晶体易散热。反之，缓慢的冷却常得到较粗大的晶体。例如土霉素的水溶液以氨水调pH至5，温度自20降低到5，使土霉素碱结晶析出，温度降低速度越快，得到的晶体的比表面积就越大，母液中土霉素含量则越低。
温度升高也使成核速度和晶体生长速度加快，但对后者影响较显著。因此，在较低的温度下结晶，得到的晶体较细小。例如普鲁卡因青霉素结晶时所用晶种，粒度要求在2μm左右，制备晶种时温度要保持在-10左右。必须注意，温度改变时，常会导致晶型和结晶水的变化。
③搅拌能促使成核，提高晶核长大速度。但当搅拌强度到一定程度后，再加快搅拌效果就不显著，反而会将晶体打碎。搅拌越快，晶体越细。
2.晶体的形状
同种物质用不同方法结晶时，得到的晶体形状可以完全不一样，虽然它们属于同一种晶系，外形的变化是由于在一个方向生长受阻，或在另一方向生长加速。过饱和度、搅拌、pH等也对晶形有影响。从不同溶剂中得到的结晶体常有不同的外形。如普鲁卡因青霉素在水溶液中结晶得方形晶体，而从醋酸丁酯中结晶则呈长棒状。杂质的存在也会影响晶形。杂质可吸附在晶体表面上，而使其生长速度受阻。改变结晶温度，也会改变晶体外形。例如红霉素乳酸盐在丙酮中加碱、加水结晶的工艺中，在20结晶得到的是针状晶体，易夹带母液和杂质。而在55下结晶时，则得到片状结晶。
3.晶体的纯度
从溶液中得出的晶体并不是十分纯粹的，常会包含母液、尘埃和气泡等。所以结晶器需非常清洁，结晶液也应仔细过滤，以防止夹带灰尘、铁锈等。要防止夹带气泡可不进行强烈搅拌和避免激烈翻腾。晶体表面有一定的物理吸附能力，因此表面上有很多母液和杂质。晶体越细小，表面积越大，吸附的杂质也就越多。表面吸附的杂质可通过晶体的洗涤除去。对于非水溶性晶体，常可用水洗涤，如红霉素、制霉菌素等。有时用溶剂洗涤能除去表面吸附的色素，对提高成品质量起很大作用。例如灰黄霉素晶体，本来带黄色，用丁醇洗涤后就显白色；又如青霉素钾盐的发黄变质主要是成品中含有青霉烯酸和噻唑酸，而这些杂质都很易溶于醇中，故可用丁醇洗涤除去。用一种或多种溶剂洗涤后，为便于干燥，最后常用易挥发的溶剂，如乙醇、乙醚、醋酸乙酯等冲洗。为加强洗涤效果，最好是将溶剂加到晶体中，搅拌后再过滤。边洗涤边过滤的效果较差，因为沟流的关系使有些晶体没有洗到。必须着重指出，太细的晶体不仅吸附的杂质多，而且使洗涤过滤很难进行，甚至影响生产。
当结晶速度过快时（如过饱和度较高，冷却速度很快时），常易形成包含母液等杂质的晶簇，或因晶体对溶剂有特殊的亲和力，晶格中常会包含溶剂。对于这种杂质，用洗涤的方法不能除去，只能通过重结晶来除去。例如红霉素碱从有机溶剂中结晶时，每1分子碱可含1～3个分子有机溶剂，用通常加热的方法很难除去，而要用水中重结晶的方法除去。
选择不同的溶剂进行结晶也会影响成品的纯度，这是因为不同的溶剂对杂质的溶解能力不同。例如红霉素乳酸盐在丙酮或乙醇中转碱、加水结晶的工艺中，由于乙醇对杂质红霉素C有较大的溶解度，故成品中红霉素C含量较低。但丙酮在以氨水碱化时会形成两相，分去下面的水相除去一部分杂质，故从丙酮中得到的成品，杂质总量较低。
有些杂质与产品具有相同的晶型，称为同晶现象。对于这种杂质，利用重结晶的方法也很难除去，需用其他物理化学分离方法除去。
4.晶体的结块
晶体的结块给使用带来不便。结块的主要原因是母液没有洗净，温度的变化会使其中溶质析出，而将颗粒胶结在一起。另一方面吸湿性强的晶体容易结块。当空气中湿度较大时，表面晶体吸湿溶解成饱和溶液，充满于颗粒缝隙中，以后如空气中湿度降低时，饱和溶液蒸发又析出晶体，而使颗粒胶结成块。
粒度不均匀的晶体缝隙较少，晶粒相互接触点较多，因而易结块，所以晶体粒度要求均匀一致。要避免结块，还应储藏在干燥、密闭的容器中。
5.重结晶
重结晶，特别是在不同溶剂中反复结晶，能使纯度提高。因为杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度是不同的。
重结晶的关键是选择合适的溶剂。如溶质在某种溶剂中加热时能溶解，冷却时能析出较多的晶体，则这种溶剂可以认为适用于重结晶。如果溶质溶于某一溶剂而难溶于另一溶剂，且该两溶剂能互溶，则可以用两者的混合溶剂进行试验。其方法为将溶质溶于溶解度较大的一种溶剂中，然后将第二种溶剂加热后小心地加入，直到稍显浑浊，结晶刚开始为止，接着冷却、放置一段时间使结晶完全。
（三）发酵工业中常用的结晶方法
1.等电点结晶
等电点结晶即调节溶液的pH接近等电点，使溶质结晶析出，是氨基酸提取常用方法之一。
2.添加有机溶剂结晶
此法是调节溶液的pH或添加有机溶剂生成新物质，使其浓度达到过饱和。
3.将部分溶剂蒸发结晶
适用于溶解度随温度变化不显著的发酵产品的结晶。例如灰黄霉素的丙酮萃取液真空浓缩除去丙酮后，即可得到晶体析出。
4.将热饱和溶液冷却，添加晶种结晶
将接有晶种的热饱和溶液缓慢冷却，控制温度，以使系统始终处于介稳区，系统因未能达到不稳定区，不会自动生成晶核。此法适用于溶解度随温度降低而显著减少的发酵产品的结晶。如谷氨酸和柠檬酸。
5.盐析结晶
此法是添加一种物质于溶液中，以使溶质的溶解度降低，形成过饱和溶液而结晶的方法，通常称为盐析法。这种物质可以是有机溶剂或能溶于溶液中的物质。加入的有机溶剂必须和原溶剂能互溶，常用于酶制剂和抗生素的精制。
二、电泳
电泳法是靠溶质在电场中移动速度不同而分离的方法。溶质必须带电，它本身可以是离子或由于吸附离子而带电。电泳中因通电发热等原因而引起的对流，常会使已分离的溶质重新混合。为了防止对流，可将电泳在多孔介质中进行，称为区带电泳，而多孔介质称为载体。应用最普遍的是凝胶电泳法。
凝胶电泳法的作用是基于凝胶过滤作用（分子筛作用）和电泳淌度双重机理，所以它能获得较高的分辨率，且操作方便、应用面广。常用的凝胶材料是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。聚丙烯酰按含量为7.5%的凝胶，适用的相对分子质量范围为10000到1000000，而能产生最佳分辨率的相对分子质量范围是30000到300000.聚丙烯酰胺含量为3.5%的凝胶，可适用的相对分子质量范围为1000000到5000000，高于5000000的生物大分子物质的电泳，需采用琼脂糖和聚丙烯酰胺的混合物，或者单一琼脂糖凝胶。
凝胶电泳与凝胶过滤的区别是，在凝胶电泳中，样品混合物中各分子的运动速度是小分子物质>；大分子物质，这和凝胶过滤中的情况恰好相反。这是因为在凝胶电泳中，系统里没有空隙体积，只有充满整个凝胶的连续的网状骨架。因此，在其内部大分子物质不及小分子物质容易移动。
凝胶电泳可以装柱操作，也可以铺板操作。
近来，聚丙烯酰胺凝胶电泳法有了两个新进展，它们是不连续凝胶电泳和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.不连续凝胶电泳
不连续凝胶电泳由两层组成，一层为上层，或叫堆积凝胶层，另一层为下层，或叫分辨凝胶层。这两层凝胶的性质不同，上层的聚丙烯酰胺含量较低（2%～3%），所以孔度较大。另外，两层凝胶在制备时所用缓冲液的pH和离子强度也不相同。上层pH6.9，下层pH8～9，样品所用缓冲液通常应为pH8～9的甘氨酸-HCl缓冲液，在这样的pH时，甘氨酸以两性离子和阴离子状态存在：
H3N++CH2COO→-H2NCH2COO-+H+
通电后，样品进入上层，pH发生变化，甘氨酸两性离子的状态增加。于是可以移动的甘氨酸负离子数减少，在pH6.9以下大多数蛋白质或核酸仍为负离子，于是它们替代了甘氨酸负离子向电泳系统中的阳极方向移动，所以在上层凝胶中各种离子的相对淌度是Cl->；蛋白质或核酸>；甘氨酸负离子。因此，样品中蛋白质或核酸必定被夹在Cl-和甘氨酸负离子之间，形成一个狭窄的浓缩区带。当样品区带进入下层凝胶时情况有所不同，那里pH又变成8～9，甘氨酸负离子浓度开始增加，移动速度也增加，而由于下层凝胶电泳孔度小，所以蛋白质、核酸类物质的移动速度却相对减慢。在下层凝胶中，它们按凝胶电泳的方法，根据各组分的电荷值、分子大小、空间构型等物性进行分离。不连续凝胶电泳法对样品的浓缩效应好，能在电泳分离前就将样品浓缩成极薄的带，从而使样品得到很好的分辨。
2.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在分析蛋白质时往往希望破除共价键以外的其他分子间的键，虽然无机的强酸、强碱能解离或溶解许多蛋白质，但有使蛋白质肽键裂解、重排或使某些氨基酸发生化学上改变的危险。目前广泛使用的较温和而有效的解离试剂是阴离子去污剂――十二烷基硫酸钠（SDS）。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS-PAGE）这一方法主要用于分析测量生物大分子物质的相对分子质量，它利用十二烷基硫酸钠（SDS）和二硫苏糖醇（DTT）或巯基乙醇作变性剂使蛋白质解体成为多肽。而SDS分子中的直链烷烃部分与多肽链的疏水区以疏水作用相结合，络合物带上负电荷。当在电场中移动时，它的淌度便决定于它的相对分子质量，较小的分子有较大的淌度，而较大的分子受凝胶分子筛效应的阻滞，淌度较小。
SDS是一种阴离子表面活性剂，在水溶液中以单体和分子胶团的混合体而存在，单体和分子胶团的浓度与SDS总浓度、离子强度以及温度有关。分子胶团在临界胶团浓度（criticalmicelle concentration，简称CMC）以上时，SDS总浓度再大也不会使单体浓度增加了，也就是说在此临界值以上时单体浓度达到平衡。在温度不变的情况下离子强度愈高而分子胶团浓度愈低，可见只要改变离子强度就能使单体和分子胶团浓度改变。与蛋白质结合的是单体，因此若要保证所有蛋白质分子能与SDS结合就应控制SDS在水溶液有一定的平衡浓度，当离子强度低到一定程度（0.1mmol/L以下）时，使分子胶团临界浓度提高，单体浓度也随着提高。单体浓度在0.5mmol/L以上时蛋白质和SDS结合成复合物。大多数蛋白质在SDS单体浓度大于1mmol/L时，以1.4g SDS/g蛋白质的比例结合。当SDS浓度高达1～2g/100mL时其结合比例甚至能达到2g/g蛋白质。尽管有少数例外，但大多数蛋白质都能与SDS在质量/质量的基础上以同等比例结合，蛋白质带上大量SDS的阴离子，所结合的SDS的负电荷大大超过了天然蛋白质的电荷，因而就消除了不同蛋白质之间的电荷差。和SDS等比例结合后，蛋白质之间的不同泳动率反映了各蛋白质间相对分子质量的差别。酸性蛋白质因带负电荷，与SDS相互排斥，不易结合。核糖核酸酶因有相当牢固的二硫键维持其高级结构，也很难与SDS结合。
与SDS结合的蛋白质其构型发生改变，如原来螺旋构型较少的蛋白质与SDS结合后螺旋增加了。由亚单位组成的蛋白质和SDS结合后大多数都解离成亚单位并同时失去原有的活性。SDS-蛋白质复合物的形状是细杆状，其粗细与蛋白质种类无关，其长度与蛋白质相对分子质量成正比。
操作时，未知相对分子质量的蛋白质与已知相对分子质量的蛋白质标准混合物一起进行凝胶电泳。蛋白质标准混合物有两组，一组可用做低相对分子质量蛋白质的标准（蛋白质的相对分子质量范围在14000～200000之间），而另一组，可用做高相对分子质量蛋白质的标准（相对分子质量范围在45000～200000之间）。在电泳之后，将凝胶用染料显色，根据标准混合物的色带图谱，可以求得未知相对分子质量的物质的相对分子质量范围。
三、色谱分离
色谱分离（chromatographic resolution，CR）亦称为色层分离或层析分离，在分析检测中则常称做为色谱分析（chromatographic analysis，CA）。它是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中。其中一个相为固定的，称为固定相；另一个相则流过此固定相，称为流动相。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。
与其他分离纯化方法相比，色谱分离具有如下基本特点：分离效率高，应用范围广，选择性强，高灵敏度的在线检测，快速分离，过程自动化操作。
（一）色谱分离的原理与分类
按照溶质分子与固定相相互作用的机理不同，色谱分离可大致分成如下五大类。
1.吸附色谱分离
吸附色谱（adsorption chromatography，AC）是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。吸附是指固体表面对气体分子或液体分子的吸着现象，其作用力可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用，如范德华力、静电力、共价结合力及氢键作用等。物理吸附的特点是无选择性，吸附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条件下也可以互相转化。
吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸附剂，如氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙（凝胶型和晶型）、氧化钛、氢氧化锌凝胶等，其吸附过程包括多种作用力，作用机理较为复杂。在此基础上发展起来的新的吸附色谱技术，如疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）、金属螯合作用色谱（metal chelation chromatography，MCC）和共价作用色谱（covalent interaction chromatography，CIC）等，所用吸附剂一般为有机基质并通过化学修饰后制成，它们都有比较明确的作用机理，即疏水作用、螯合作用和共价作用。
2.分配色谱
分配色谱（distribution chromatography，DC）的流动相和固定相都是液体，因而又称为液-液色谱，其原理是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。根据分配原理进行色谱分离操作的方法有两种：一种是柱（纸或板）色谱分离法，其固定相是将与流动相互不相溶的液体涂渍到载体上形成的；另一种是逆流分配法，其固定相（重相）和流动相（轻相）都放在一组特别的分配管中，用来完成这种操作的仪器称为逆流分配仪。
根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱又可分为正相色谱和反相色谱。正相色谱（normal phase chromatography，NPC）的固定相为极性，流动相为非极性，当混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物被保留，极性较弱的化合物先被洗脱下来。反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）则固定相为非极性，流动相为极性，用于分离非极性或弱极性物质。
3.离子交换色谱
离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。该法适合于离子和在溶剂中可发生电离的物质的分离。大多数生物大分子都是极性的，都可使其电离，所以离子交换色谱广泛用于生物大分子的分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，离子交换色谱分离占主导地位。
20世纪70年代中期，由美国DOW化学公司开发的离子色谱（ion chromatography，IC）现已成为一个独立的色谱分支。该法使用离子交换原理，采用一种新的树脂组合方法，即在分离柱后串联一个扣除背景用的抑制柱，在抑制柱中将作为洗脱液的酸或碱溶液转变为水或另一种电导率极低的溶液，从而能用电导检测器测定洗脱后溶液中的待测离子。由于IC法能够快速灵敏地测定各种痕量的阴阳离子物质，解决了IEC和其他方法所不能解决的分析检测问题，因而在环保、能源、材料、水质、食品、医药以及包括生命科学在内的许多基础研究领域中得到广泛的应用。
4.凝胶色谱
凝胶色谱（gel chromatography，GC）以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱（molecular sieve chromatography，MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起首先流出；较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的速率较慢；更小的分子能进入全部凝胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。
凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及相对分子质量的测定。脱盐是分离大小两类不同的分子，即无机盐与生物大分子；分级是将分子大小相近的物质分开，通常为生物大分子间的分离。采用凝胶色谱法能简便快速地分离那些样品组分中相对分子质量相差较大的简单化合物。对于复杂的未知样品，可采用凝胶色谱分离法进行初步分级分离，无需进行复杂实验就能获得样品组成分布方面较为全面的概况。
凝胶色谱按其流动相的不同分为两大类：一类是水相系统，称为凝胶过滤色谱（gel fil-tration chromatography，GFC），其所用凝胶是亲水性的，用来分离水溶性大分子化合物；另一类是有机相系统，称为凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC），其所用凝胶是疏水性的，用来分离油溶性的高分子化合物。
5.亲和色谱
亲和色谱（affinity chromatography，AFC）作为色谱分离技术的一个分支，对于生物大分子化合物的分离纯化具有特别重要的意义。众所周知，生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，如酶蛋白与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力称亲和力。如果把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则当含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。
在实际操作中，不同的分离机理常同时存在。例如：在硅胶薄层色谱中，同时包含吸附作用和分配作用；在生物大分子的离子交换色谱分离中，有时会包含离子交换作用、吸附作用、分子筛作用和生物亲和作用等机理。此外，离子交换作用和亲和作用亦可看做是特殊的吸附作用，因而也可把离子交换色谱和亲和色谱归类于吸附色谱。由此看来，上述分类仅具有相对意义。另外，根据固定相的形状不同，色谱分离技术可分为柱色谱、纸上色谱和薄层色谱三类；根据流动相的物态不同，可分为气相色谱分离、液相色谱分离和超临界色谱分离。
（二）柱色谱分离操作
发酵工业的色谱分离大多采用柱色谱分离法，而且吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱等都可在柱中进行，它们的实验装置和操作方法也基本类似。在此简要介绍柱色谱的操作情况。
1.层析剂
用于色谱分离技术中的固定相或分离介质，总称为层析剂，它由基质和表面活性功能团（或活动中心）组成。层析剂的基质材料应为化学惰性物质，与目的产物和杂质都无结合作用，并应具有下列特性。
①不溶于流动相，且具有较好的化学稳定性和机械强度；能经受使用、清洗和再生时的各种环境条件；对于生物活性物质的分离，还必须能耐受生物降解作用。
②具有较大的表面积和孔隙度，且粒度、孔径分布均匀。
③有较高的回收率和负载量，能达到所需的分离效率，且重现性好。
④有些分离过程，层析剂使用前后需要高压消毒，此时层析剂应具有较好的热稳定性。
⑤无毒性，分离过程不引起目的产物的变性或失活。
⑥成本较低，价格合理。
层析剂的种类很多，按化合物的种类可分成无机基质层析剂和有机基质层析剂两大类。
无机基质层析剂常用的基本材料有硅胶、氧化铝、活性炭、多孔玻璃、磷酸钙等。将这些无机材料制成适宜应用的球形或无定形颗粒，可直接用于吸附和正相分配色谱。其中有些无机材料经化学修饰或涂层改性后，可制成不同分离机理的层析剂，以满足不同的分离目的。
有机基质层析剂主要有琼脂糖（agarose）、葡聚糖（dextran）、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶和聚乙烯醇等，与无机基质比较，有机基质材料具有如下特征：
①基质微粒可广泛选择单体和交联剂聚合进行化学改性处理，所合成的层析剂产品普遍具有良好的选择性；
②层析剂负载能力强，有较高的色谱容量；
③具有良好的化学稳定性，可在广泛的pH范围内使用；
④不易产生不可逆的吸附作用，特别是对于生化物质的分离能较好地保存其生物活性。
有机基质所表现出来的这些良好性能，已越来越受到研究者和使用者的重视，使其成为层析剂发展的主要方向。有机基质材料的不足之处在于，颗粒刚性不如无机基质，孔结构复杂，在洗脱体系的变化过程中可能会产生膨胀或收缩现象。这些影响色谱柱效率的因素，仍有待于研究解决。
2.装置
柱色谱装置一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及馏分收集器等部分构成，其中色谱柱是色谱分离装置的关键部件。
色谱柱通常用玻璃柱，这样可直接观察色带的移动情况，柱应该平直、直径均匀。工业上的大型色谱柱可以用金属制造，有时在柱壁嵌一条玻璃或有机玻璃狭带，便于观察。一般情况下，柱的分离效率与柱长成正比，和柱的直径成反比，因此色谱柱L/D=20～30.柱直径大多为2～15cm。在分离生物物质时，有些色谱柱需带有夹套以保持操作过程能在适宜的温度下进行。还有些柱应能进行消毒，以免微生物的污染。消毒可以是高压消毒，也可以用过氧乙酸等杀菌剂消毒。
3.操作
（1）装柱 色谱柱填装的好坏，对色谱分离的效果有很大的影响，不均匀的填装必然引起不规则的流型。实际上层析剂颗粒大小多少有些不匀，大颗粒沉降快，集中在底部，柱的上部小颗粒较多。这样在柱长度上有效结合位置分布不均匀，而且柱的上部与下部，流动相流速也不一样。如果装柱时，层析剂分批加入，那么柱内颗粒大小成为分段分布，因而同样会产生不均匀的流动。装柱时，最好将层析剂先与不超过层析剂用量的一份缓冲液调成浆料，然后将浆料慢慢地边加边搅拌，一次加完。同时，将柱底部的出口阀打开，以便层析剂迅速沉降。倾倒完浆料之后，再用几倍体积的缓冲液流过色谱柱以保证平衡。这一点对离子交换层析剂特别重要。浆料中如有空气，可以用真空抽吸除去。
（2）进样 进样时，先除去柱上部过多的缓冲液，使液面恰好达到床层的顶面。然后关上出口阀，用一个注射器沿柱壁将样品溶液慢慢铺在床层顶面。进样量大时，则用高压泵直接输送样品进入色谱柱。打开出口阀，慢慢排出下部流出液，使样品进入顶面。再用洗脱缓冲液小心地洗脱上部柱壁，直到柱层上面有1～2cm的溶液，最后连接柱的进口，开始进行洗脱。
（3）洗脱 样品上柱后，加入洗脱剂使样品分离并收集目的产物。展开操作的方式有多种，在实际使用中选择何种操作方式取决于样品的性质、所需产品的纯度及要求的产率等，有洗脱展开法、前沿分析法和置换展开法三种基本洗脱操作。其中洗脱展开法是展开操作中应用最广的一种方法。
在洗脱展开法操作时，先将样品输入色谱柱，随即加入一种不与固定相发生作用的溶剂或几种溶剂的混合物作为流动相冲洗。在洗脱过程中，各组分因与固定相的作用力不同而分离，并随溶剂向下移动，最后有顺序地全部流出色谱柱。以流出液体积对溶质浓度作图，为由一系列的峰组成的曲线，每一个峰对应于一个组分，最先出现的峰是与固定相作用力最弱的物质，以后顺次出现的峰其溶质与固定相的作用力顺次增加。峰的面积与溶质含量成正比，由此可做定量分析。在此法中，组分的保留体积为开始加入样品至该组分峰顶出现时所流出的液体体积。
根据洗脱过程中洗脱剂的组成是否改变，洗脱展开法可分为恒定洗脱法、逐次洗脱法和梯度洗脱法。恒定洗脱法在整个洗脱过程中不改变洗脱剂的组成。此法的优点是操作简单，不需较复杂的设备。但洗脱剂的合理组成常常需要通过实验来确定，太弱的洗脱剂不能有效洗脱，太强的洗脱剂分辨能力较差。当样品中各组分间的保留容积差别较大时，组分间可相互分开。但当组分间与固定相的作用力相近时，就会出现重叠峰或峰间不清，此时样品不能很好分离；逐次洗脱法在洗脱过程中，洗脱剂的组成至少改变一次。逐次洗脱法设备要求亦较简单，重现性较好，故常可用于较大规模的色谱分离操作中。逐次洗脱法的问题是，在洗脱条件一次改变后，有些组分可能会被共同洗脱下来，影响分离效果；梯度洗脱法就是逐渐改变洗脱剂的组成，使洗脱条件更有利于混合物的分离，从而消除重叠峰现象。
