种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件两个方面。生产用种子质量是由孢子的质量和种子罐种子的质量决定的。这就是说既要有优良的菌种，又要有良好的培养条件才能获得高质量的种子。
一、影响孢子质量的因素及孢子质量的控制
（一）影响孢子质量的因素
发酵生产的好坏与孢子质量密切相关。因此，各发酵工厂都非常重视孢子质量，并根据生产实践总结出控制孢子质量的经验。一般来说，发酵单位高、生产性能稳定的纯种孢子被认为是优质孢子。凡是能影响孢子质量的因素，都要严格加以控制。影响孢子质量的因素概括起来有以下几个方面。
1.培养基
配制孢子培养基所用的原材料的产地、品种、加工方法和用量对孢子质量都有一定的影响。生产过程中孢子质量不稳定，常常是由于培养基原材料质量的不稳定造成的。原材料产地、品种和加工方法的不同，会导致培养基中的微量元素和其他营养成分含量的变化。例如，由于生产蛋白胨所用的原材料及生产工艺的不同，蛋白胨的微量元素含量、磷含量、氨基酸组分均有所不同，而这些营养成分对于菌体生长和孢子形成都有重要作用。
生产实践中还发现，琼脂的牌号不同，对孢子质量也有影响。据分析，这是由于不同牌号的琼脂含有不同的无机离子造成的。
此外，水质的影响也不能忽视，特别是在一些水源污染严重、硬度较大、水质较差的地区。地区的不同、季节的变化和水源的污染，均可引起水质波动，从而影响孢子的质量。为了消除水质波动对孢子质量的影响，可在蒸馏水或无盐水中加入适量的无机盐，供配制培养基使用。
斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间，使斜面无冷凝水。斜面培养基的水分适中，有利于孢子生长。
配制孢子培养基，还应该考虑不同代谢类型的菌落对氮源的选择利用。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落。氮源不同，菌落的表现也不同；氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，这样不利于生产的稳定。在斜面培养基中采用较单一的氮源，可抑制某些不正常型菌落的出现。而在分离筛选的平板培养基中，则需要加入较复杂的氮源，使多种菌落类型充分表现，以利筛选。
2.培养温度和湿度
培养温度对多数菌种的孢子质量有显著影响。微生物能在一个较宽的温度范围内生长，但要获得高质量的孢子，其最适温度区间却很狭窄。一般来说，提高培养温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培养时间。因为菌体的糖代谢和氮代谢所需要的各种酶类对温度的敏感性不同，所以培养温度不同，菌体的生理状态也不同。如果不是用最适温度培养的孢子，其生产能力就会下降。不同的菌株要求的最适温度不同，需要通过试验考察来确定。例如，龟裂链霉菌斜面的最适温度为36.5～37；如果温度高于37，则孢子成熟早、易老化；这样的孢子接入发酵罐后，就会出现菌丝对碳氮利用缓慢、氨基氮回升提前、发酵产量降低等现象。培养温度控制得低一些，则有利于孢子的形成。如果将龟裂链霉菌斜面先放在36.5培养3d，再放在28.5培养1d，所得的孢子数量比在36.5培养4d所得的孢子数量增加3～7倍。
斜面孢子培养时，培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。空气相对湿度高，培养基内的水分蒸发少；空气相对湿度低，培养基内的水分蒸发多。如空气相对湿度偏低，斜面培养基内的水分蒸发快，致使斜面下部含有一定水分，而上部干瘪，这时孢子长得快，且从斜面下部向上长；空气相对湿度高，斜面内水分蒸发慢，这时斜面孢子从上部往下长，下部常因积存冷凝水而使孢子生长缓慢或孢子不能生长。试验表明，在一定条件下培养斜面孢子时，在北方相对湿度控制在40%～45%，而在南方相对湿度控制在35%～42%，这样得到的孢子质量较好。一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。
在培养箱培养时，如果相对湿度偏低，可放入盛水的平皿，提高培养箱内的相对湿度。为了保证新鲜空气的交换，培养箱每天宜开启几次，以利于孢子生长。现在大部分实验室已采用调温调湿的培养箱，可以保证恒温、恒湿和自动换气，则不需人工控制。
最适培养温度和湿度是相对的。如果相对湿度、培养基组分不同，对微生物的最适温度会有影响，培养温度、培养基组分不同，也会影响到微生物培养的最适相对湿度。
3.培养时间和冷藏时间
丝状菌在斜面培养基上的生长发育过程可分为孢子发芽和基质菌丝生长阶段，气生菌丝生长阶段，孢子形成阶段，孢子成熟阶段，孢子衰老与菌丝自溶阶段。
在丝状菌生长发育的前两个阶段，基质菌丝和气生菌丝内部的物质和细胞质处于流动状态，如果把菌丝断开，各菌丝片断之间的内生质量是不同的，有的片断中没有核粒，有的片断中含有核粒，核粒的多少亦不均匀。该阶段的菌丝不适宜于菌种保存和传代。在孢子形成和成熟阶段，孢子本身是一个独立的遗传体，其遗传物质比较完整，因此这两个阶段的孢子用于传代和保存均能保持原始菌种的基本特征。但是孢子本身亦有年轻与衰老的区别。一般来说衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，物质趋于分化状态。所以在孢子培养工艺中，一般选择在孢子成熟阶段时终止培养，此时显微镜下可见到成串孢子或游离的分散孢子；如果继续培养，则进入孢子衰老、菌丝自溶阶段，表现为斜面外观变色、发暗或发黄、菌层下陷，有时出现白色斑点或发黑。白斑表示孢子发芽长出第二代菌丝，黑色显示菌丝自溶。
孢子的培养时间对孢子质量有重要影响。过于年轻的孢子经不起冷藏，如土霉素菌种斜面培养4.5d，孢子尚未完全成熟，冷藏7～8d菌丝即开始自溶。而培养时间延长半天（即培养5d），孢子完全成熟，冷藏20d也不会自溶。过于衰老的孢子会导致生产能力下降。孢子的培养时间应控制在孢子量多、成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。
斜面孢子的冷藏时间对孢子质量也有影响，其影响随菌种不同而异。总的原则是冷藏时间宜短不宜长。曾有报道，在链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1个月的低18%，冷藏3个月后则降低35%。
4.接种量
接种量过大或过小均对孢子质量产生影响。因为接种量的大小直接影响一定量培养基中孢子的个体数量，进而影响菌体的生理状况。凡接种后菌落均匀分布于整个斜面、隐约可分菌落者为正常接种量。接种量过小则斜面上长出的菌落稀疏；接种量过大则斜面上菌落密集一片。一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐的斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。一般一支高度为20cm、直径为3cm的试管斜面，丝状菌孢子数要求达到1×107个以上。
接入种子罐的孢子数量对发酵生产也有影响。例如，青霉素产生菌之一的球状菌的孢子数量对青霉素发酵产量影响极大。孢子数量过少，则进罐后长出的球状体过大，影响通气效果；若孢子数量过多，则进罐后不能很好地维持球状体。
（二）孢子质量的控制措施
①砂土管要保存在有干燥剂的容器中，并同冷冻管及液体石蜡封存的斜面菌种一样，放在4左右的冰箱中。各种方法保存的菌种每过一年左右都应该进行一次自然分离，从中选出形态、生产性能好的单菌落接种孢子培养基。制备好的斜面孢子，要经过摇瓶发酵试验，合格后才能用于发酵生产。
②斜面培养基所用的主要原材料，需要经过糖、氮、磷含量的化学分析和摇瓶发酵试验，合格后才能使用。对不合格的原材料，必须采取适当措施。例如制备抗生素产生菌的斜面培养基时，如果没有优质的琼脂而只有碎琼脂，可以用蒸馏水将碎琼脂浸渍10min，反复2～3次，捞出晾干后使用，效果也很好。另外，制备培养基时还要严格控制灭菌后培养基的质量。
③制备的斜面孢子，在外观上应生长丰满、色泽正常，并且要先经过摇瓶发酵试验，合格后才能用于生产。
④要注意观察斜面外观与产量之间的相关性。例如四环素产生菌的砂土孢子的正常菌落有两种，一种边缘整齐、鼠灰色、有螺纹条，另一种是中间有凸起的所谓“草帽型”，这两种菌落的发酵单位均较高。而从砂土孢子长出来的菌落约有10%不长孢子或是菌落异常，这些异常菌落的发酵单位都很低，只有正常菌落发酵水平的10%左右。
总之，孢子质量与培养基、培养温度和湿度、培养时间和接种量等诸因素都有关系，且这些因素之间又有机地相互结合、相互联系和相互制约，因此对各种因素必须全面考虑，认真加以控制。
二、影响种子质量的主要因素及种子质量的控制
种子的质量是发酵能否正常进行的重要因素之一。种子制备不仅是要提供一定数量的菌体，更重要的是为发酵生产提供适合发酵、具有一定生理状态的菌体。
（一）影响种子质量的主要因素
摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度或黏度以及糖氮代谢、pH变化等为指标。种子罐种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。
1.培养基
培养基是微生物生存的营养来源，种子培养基的质量对于微生物的生长繁殖、微生物酶的活性和微生物发酵产物的产量都有直接影响。种子培养基原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质量的控制。种子培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基。在营养上要易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮并具有较强的活力。另一方面，培养基的营养成分要尽可能地和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样的种子移入发酵罐能比较容易适应发酵罐的培养条件。发酵的目的是为了获得尽可能多的发酵产物，其培养基一般比较浓，而种子培养基以略稀薄为宜。种子培养基的pH要比较稳定，以适合菌的生长和发育。pH的变化会引起各种微生物酶活力的改变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。
不同类型的微生物所需要的培养基成分与浓度配比并不完全相同，必须按照实际情况加以选择。发酵产物产量提高是选择培养基的一个重要标准，但同时还应当要求培养基组成简单、来源丰富、价格便宜、取材方便等。一般来说，种子罐是培养菌体的，培养基的糖分要少，而对微生物生长起主导作用的氮源要多，而且其无机氮源所占的比例要大些。但是种子罐和发酵罐的培养基成分相同也有益处。处于对数生长期的菌种，从种子罐转移到生长环境比较相近的发酵罐中，可以大大缩短菌种生长过程的延滞期，进而缩短发酵生产周期。因此，种子罐和发酵罐的培养基成分趋于一致较好。但培养基中各成分的数量（即原料配比）还需根据不同的培养目的来确定。
任何生产所用的培养基成分，都没有一个可以完全确定的配比。对于某一菌种和具体设备条件来说，最适宜的配比应该进行多因素的考察，通过对比试验来确定。如果菌种的特性或设备条件（如罐型、搅拌的形式和转速等）变化较大，则培养基的配比应通过试验相应地变化。只有培养基中各成分的比例选得比较恰当，才能最大限度地发挥菌种的特性，提高发酵产量。
2.种龄与接种量
种子培养的时间也称种龄，应以菌种的对数生长期为宜。处于对数生长期的微生物，因其整个群体的生理特性比较一致，细胞成分平衡发展和生长速率恒定，是发酵生产中用做种子的最佳种龄。种龄过嫩或过老，都因菌种的延滞期长，不但延长发酵周期，而且会降低发酵产量。因此必须严格掌握种子的种龄，以免贻误时机。
接种量的大小直接影响发酵周期。大量接入成熟的菌种，可以缩短微生物生长过程的延滞期，因而缩短发酵周期，节约发酵培养的动力消耗，提高设备利用率，并有利于减少染菌机会。所以一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发酵。但是，如果培养基内的环境条件对菌体生长比较有利，则接种量对菌种延滞期的影响较小。一般来说，接种量和菌种的延滞期长短呈反比。接种量大，菌种的延滞期短；接种量小，菌种的延滞期则长。但在发酵生产上，过于增大接种量也没有必要，因为种子培养比较费时；而且接种量过大，势必过多地向发酵罐中移入代谢废物，这样反而会影响正常发酵。
3.温度
由于微生物的生命活动是由一系列酶参与的生物化学反应构成，而这些反应受温度的影响极为明显，所以温度是通过影响酶反应速度来影响微生物的生命活动的。因此，温度是影响微生物生长的最重要因素之一。通常在生物学范围内，温度每升高10，微生物的生长速度就加快一倍。
任何微生物的生长都有最适的生长温度，在此温度范围内，微生物的生长和繁殖最快。大多数微生物最适生长温度都在25～37.细菌的最适生长温度大多比霉菌高。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，那么采用高温培养种子，可减少污染杂菌机会和夏季培养所需降温的辅助设备，对工业生产有很大好处。
温度和微生物生长的关系可以从以下两个方面分析。一方面，在微生物最适生长温度范围内，微生物生长速度随温度升高而加快；另一方面，处于不同生长阶段的微生物对温度的反应不同。例如，处于延滞期的细菌对于温度的影响十分敏感，如将其置于最适生长温度附近，可以缩短其生长的延滞期；如将其置于较低的温度，则要延长其延滞期；而且孢子萌发的时间在一定温度范围内也随温度的上升而缩短。处于对数生长期的细菌，一般情况下，如果在略低于最适温度几度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，升温的破坏作用也不大。因为在最适生长温度的范围内，组成菌体的蛋白质很少变性，所以在最适温度范围内适当提高对数生长期的培养温度，既有利于菌体的生长，又不会引起热作用的破坏。一般来说，处于生长后期即衰亡期的细菌的生长速度，主要取决于溶解氧而不是温度，因此在培养后期，最好提高一些通气量，有利于菌体生长。此外，每种微生物都有自己的最高生长温度和最低生长温度，不管微生物处于哪个生长阶段，如果培养温度超过微生物的最高生长温度，微生物都要死亡；如果培养温度低于微生物的最低生长温度，则微生物生长就要受到抑制。
为了保证种子质量，生产上种子罐内的温度应控制在菌种最适生长温度。为了保证种子罐的温度在此范围内，常常在种子罐上装有热交换设备如夹套、排管或蛇管等进行温度调节。如果是好氧培养，冬季里通入的无菌空气也要预先加热，避免因通入低温空气引起种子培养液的温度波动。
4.pH
培养基的pH对微生物的生命活动有显著影响。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH。同一菌种合成酶的类型与酶系组成可以随pH的改变而产生不同程度的变化。如黑曲霉合成果胶酶时，如培养基pH在6.0以上，则果胶酶形成受到抑制；如培养基pH改变到6.0以下，就形成果胶酶。泡盛曲霉突变株在pH6.0培养时以产生α-淀粉酶为主，糖化型淀粉酶与麦芽糖酶产生极少；在pH2.4条件下培养，转向糖化型淀粉酶与麦芽糖酶的合成，α-淀粉酶受到抑制。
由此可见，培养基的pH与微生物的生命活动和酶系组成关系十分密切。培养基的pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变，如阴离子（如醋酸根、磷酸根）被吸收或氮源被利用后，会使培养基pH上升；如阳离子（如NH4+、K+）被吸收或有机酸的积累，则使培养基pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接相关。为了达到微生物繁殖和合成酶的目的，培养基必须保持适当的pH。生产上pH调节的方法主要有三种，即使用酸碱溶液、缓冲液以及各种生理缓冲剂（如生理酸性与生理碱性的盐类）。
5.通气和搅拌
需氧菌或兼性需氧菌的生长与合成酶，都需要氧气的供给。不同微生物对氧的需求不同，所以在培养过程中要求的通气量也不同。即使是同一种菌种，不同生理时期对通气量的要求也不相同。因此，在控制通气条件时，必须考虑到既能满足菌种生长与合成酶的不同要求，又要节省电耗，降低生产成本。通气可以供给大量的氧，而搅拌则能将氧气分散均匀，使通气的效果更好。通过通气和搅拌，新鲜氧气可以更好地和培养液混合，使氧最大限度地溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度趋于一致，还有利于营养物质与代谢物分散均匀。此外，挡板则有助于搅拌，使溶氧效果更好。
通气量的大小与所用菌种特性、培养基性质和菌种培养阶段有关。在培养阶段的各个时期究竟如何选择通气量，同样要根据菌种的特性、发酵罐的结构、培养基的性质等许多因素通过试验确定。
通气量的大小，最好按氧溶解的速度来确定。因为只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧量时，菌体才能正常地生长和合成酶。如果氧的溶解速度小于菌体消耗氧速度，则培养基中氧的浓度就会逐渐降低，当氧的浓度降到某一浓度（称溶解氧的临界点）时，菌体生长就减慢。因此，随着菌体繁殖量加大，呼吸增强，必须随菌体吸氧量的增加相应加大通气量，以增加溶解氧的量。一般来说，培养罐内液体高度深，搅拌转速大，通气管开孔小而多，气泡在培养液内停留的时间就长，氧的溶解速度也大；而且在这些因素确定的情况下，培养基的黏度越小，氧的溶解速度也越大。
因此，在生产中应根据种子罐的结构、菌种特性、培养基的黏度和菌体生长情况等因素灵活调节通气量，使培养基中的溶解氧满足菌体呼吸的需要，得到优质种子。
6.泡沫
种子培养过程中产生的泡沫直接影响到微生物的生长和合成酶。泡沫的持久存在则影响微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除，因而影响微生物生理代谢的正常进行，不利于发酵。此外，由于泡沫大量产生，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响设备的利用率，甚至发生跑料，招致染菌，损失更大。
为了克服泡沫给种子培养造成的不良影响，在种子培养过程中要采取措施消除泡沫。培养过程中有效地控制泡沫形成，不仅可以增加装料量，提高设备利用率，同时也由于代谢过程的发酵气体及时排除，有利于生物合成。
据分析，种子培养过程中产生泡沫的原因有很多，一方面，通气和机械搅拌使液体分散和空气窜入形成气泡；另一方面，培养基中某些成分（如蛋白质及其他胶体物质）的变化或微生物的代谢活动也能产生气泡。培养过程中主要消泡方法有化学消泡剂消泡和机械装置消泡。发酵工业经常使用的消泡剂有各种天然的动、植物油以及来自石油化工生产的矿物油、改性油、表面活性剂等。这类消泡剂往往因培养液的pH、温度、成分、离子浓度以及表面性质的改变，在消泡能力上呈现很大的差别。另外，采用这些消泡剂消泡，消泡剂在培养液内残留量较高，给净化处理造成不同程度的困难。而新型的有机硅聚合物如硅油、硅酮树脂等，则具有效率高、用量少、无毒、无代谢性，同时可提高微生物合成酶速度等多种优良特性，是一类有发展前途的消泡剂。另外，改进培养基成分也是控制泡沫的重要措施之一。例如在培养基配料中增加磷酸盐，可使消泡剂添加量成倍降低。机械消泡应用较多的是设置消泡桨，即在搅拌轴上装上消泡装置，用来消除泡沫。
7.染菌的控制
染菌也是种子培养过程的大敌。一旦发现染菌，应该及时进行处理，以免造成更大的损失。染菌发生的可能原因包括设备、管道、阀门漏损，灭菌不彻底，空气净化不好，无菌操作不严或菌种不纯等。因此，要控制染菌继续发展，必须及时找出染菌的原因，采取措施，杜绝染菌事故再现。菌种发生染菌将会使各个发酵罐都染菌，因此，必须加强接种室的消毒管理工作，定期检查消毒效果，严格无菌操作技术。如果新菌种不纯，则需反复分离，直至获得纯种为止。对于已出现杂菌菌落或噬菌体噬斑的试管斜面菌种，应予废弃。在平时应经常分离试管菌种，以防菌种衰退、变异和污染杂菌。对于菌种扩大培养的工艺条件要严格控制，对种子质量更要严格掌握，必要时可将种子罐冷却，取样后做纯菌试验，确证种子无杂菌存在，再向发酵培养基中接种。
8.种子罐的级数
种子罐级数的确定取决于菌种的性质（如菌种传代后的稳定性）、孢子瓶中的孢子数、孢子发芽及菌丝繁殖速度以及发酵罐中种子培养液的最低接种量和种子罐与发酵罐的容积比等因素。如果孢子瓶中的孢子数量较多，孢子在种子罐中发育较快，且对发酵罐的最低接种量的要求亦较小，显然可采用一级种子，即二级发酵。
另外，种子罐的级数也可随产物的品种、生产规模和工艺条件的改变作适当调整。如果改变种子罐的培养条件、加速孢子的发育或改进孢子瓶的培养工艺，可大大增加孢子数量，在此基础上均有可能使三级发酵简化为二级发酵。
种子罐的级数愈少，愈有利于简化工艺及控制。级数少可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量以及减少因种子罐生长异常而造成出发菌的波动。
（二）种子质量的控制措施
种子质量的最终考察指标是其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此，保证种子质量首先要确保菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境，保证无杂菌侵入，以获得优良种子。
1.菌种稳定性检查
要保持菌种具有稳定的生产能力，需要定期考察和挑选菌种，对菌种进行自然分离，摇瓶发酵，测定其生产能力，从中挑选具有较高生产能力的菌株，防止菌种生产能力下降。
2.适宜的生长环境
确保菌种在适宜的条件下生长繁殖，包括提供营养丰富的培养基、适宜的培养温度和湿度、合理的通气量等。
3.种子无杂菌检查
种子无杂菌是纯种发酵的保证。因此，在种子制备过程中每移种一步均需要进行无杂菌检查，并对种子液进行生化分析。无菌检查是判断杂菌的主要依据，通常是采用种子液的显微镜观察和无杂菌试验；种子液生化分析项目主要是测定其营养基质的消耗速度、pH变化、溶氧利用、色泽和气味等。
三、种子质量检查
不同产品、不同菌种以及不同工艺条件的种子质量标准有所不同，况且，判断种子质量的优劣尚需要有实践经验。发酵工业生产上常用的种子质量标准，大致有如下几个方面。
（一）细胞或菌体
种子培养的目的是获得健壮和足够数量的菌体。因此，菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量的重要指标。
菌体形态可通过显微镜观察来确定，以单细胞菌体为种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态，以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强，生长旺盛，菌丝分枝情况和内含物情况良好。
菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。
种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的指标。
（二）生化指标
种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，种子液的质量也可以这些物质的利用情况及pH变化为指标。
（三）产物生成量
种子液中产物的生成量是多种抗生素发酵考察种子质量的重要指标。因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映。
（四）酶活力
测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。如土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。此外，种子应确保无任何杂菌污染。
四、种子异常的分析
在生产过程中，种子质量受各种各样因素的影响，种子异常的情况时有发生，会给发酵带来很大困难。种子异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。
（一）菌种生长发育缓慢或过快
这种现象是指在各项工艺参数正常的情况下，出现整个代谢过程过慢或过快。菌种在种子罐中生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。一般情况下，通入种子罐中无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。
（二）菌丝结团
在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝结团。当菌丝出现结团现象时，从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，在显微镜下可以观察到菌丝团的中央部分重叠而无法辨认，仅在菌丝团的边缘上，可以见到分枝的菌丝。菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。
目前，对菌丝结团的机理尚不清楚。初步分析，认为菌丝结团可能和接入种子罐的孢子量以及通气搅拌效果有关。接入种子罐的孢子量少于一定值时，即可形成菌丝团。加入某些表面活性剂如吐温80可以促进菌丝团分散，但是表面活性剂有时对产量有影响，须由试验确定。
（三）菌丝粘壁
所谓菌丝粘壁是指在种子培养过程中，菌丝正常发育生长，但再继续培养时菌丝逐步粘附在罐壁上。当菌丝繁殖速度低于被罐壁粘附的速度时，培养液中菌丝浓度愈来愈小，最后就可能形成菌丝团。菌丝粘壁的原因是搅拌效果不好，搅拌时泡沫过多，以及种子罐装料系数过小等原因造成的。在以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。
种子的异常还表现在代谢情况上。如糖、氮代谢过快或过慢，pH过高或过低，种子罐发酵单位低等。因此，检查种子的质量时，不仅以表观参数为指标，更主要的是要从代谢上来分析其内在的变化规律。根据生产实践，无论一级、二级（甚至三级）种子罐种子都有一定的代谢规律，上述的代谢情况异常的种子，都不能接入发酵罐，否则在发酵过程中必将出现代谢不正常或发酵产物产量下降的现象。
五、影响基因重组微生物种子质量的主要因素
在讨论基因重组微生物种子质量的时候，不但要考虑孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响，还要考虑重组质粒稳定性的问题，因为这种不稳定现象不仅影响基因重组微生物菌体的生长，而且也影响其对外源蛋白的表达。即凡是影响基因重组微生物生长繁殖和重组质粒稳定性的因素，都将影响基因重组微生物种子的质量。
影响基因重组微生物生长繁殖的因素如下：
①物理环境因素：主要有温度、pH、溶氧量等；
②化学环境因素：主要是菌体生长代谢所需的各种营养物质（如碳源、氮源、无机盐、生长因子等）的浓度。重组质粒稳定性也受多种因素影响，如寄主细胞的特性、质粒的类型和环境条件等。质粒的稳定性可以通过构建重组质粒时的基因操作及培养条件优化加以提高。重组缺陷菌株作为克隆基因受体菌，用不包含转座子的质粒、使用温度敏感型质粒、调控环境参数对保持重组质粒稳定性有利。对于一定结构的基因工程菌而言，优化环境条件可以提高稳定性，这对于基因工程产物的生产具有重要的意义。
影响基因重组微生物种子质量的主要因素如下。
（一）培养基的影响
微生物在不同的培养基中进行不同的代谢活动。对于基因工程菌来说，培养基组分可能通过各种途径影响着质粒稳定的遗传。所以，种子培养基的组成，既要有利于提高基因重组微生物的生长速率，又要有利于保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达。常用的碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、玉米浆和硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。另外，培养基中还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。
使用不同碳源对菌体生长和外源基因表达有较大的影响。如分别使用葡萄糖和甘油为碳源时，菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但以甘油为碳源时菌体得率较大。另外，培养基中有机氮源的种类、盐的浓度对菌体的生长和外源基因的表达都有影响。还有报道说质粒的稳定性随培养基复杂性降低而提高。
（二）培养条件的影响
1.温度的影响
重组质粒引入细胞后，引起细胞发生一系列生理变化。含有重组质粒克隆菌的比生长速率比宿主细胞小。同样，有报道说重组质粒引起宿主细胞生长温度范围发生变化。对基因工程菌的生长和基因表达都有很大影响。通常情况下，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。对某些工程菌而言，当培养温度低于50时，重组质粒非常稳定，而当培养温度高于50时，重组质粒在培养过程中表现出不稳定性。对温敏扩增型质粒来说，如培养温度升高，质粒拷贝数就处于失控状态，对菌体生长不利。对含此类质粒的工程菌，通常要先在较低的温度下培养，然后升温，以大量增加质粒拷贝数，诱导外源基因表达。
2.溶解氧的影响
溶解氧也是工程菌培养过程中影响菌体生长的一个重要因素，对菌体的生长和产物生成影响很大。菌群在大量扩增过程中，进行耗氧的氧化分解代谢，及时供给饱和氧是很重要的。在菌体生长旺盛时期，应该保证足量的氧供应或者通过调节搅拌速度，使培养液的溶氧水平满足菌体生长的需要。
氧传递对质粒稳定性的影响也很大，氧和营养供应受固定化胶粒屏障和胶粒表面高浓度细胞的限制，搅拌速率能影响细胞生长和产物合成，搅拌强度明显影响质粒丢失速率，游离和固定化细胞的质粒稳定性都随搅拌强度提高而下降，温和的搅拌速率适于保持质粒的稳定性。
3.pH的影响
pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以，应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。一般工程菌的最佳生长pH范围在6.8～7.4左右，外源蛋白表达的最佳pH范围为6.0～6.5.
（三）接种量的影响
接种量的大小影响发酵产量和发酵周期。接种量小，延长菌体延滞期，不利于外源基因的表达；采用大接种量，由于种子液中含有大量水解酶，有利于对基质的利用，可以缩短菌体生长延滞期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少染菌机会。
总之，在基因重组微生物的培养过程中，影响种子质量的参数很多，需不断加以调整，从而达到优化控制目的。高质量的基因重组微生物种子，是发酵过程中外源蛋白高效表达，得到大量产物的基础。
参考文献
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