发酵工业是利用特定微生物的生命活动获得人类需要产品的工业。大多数工业发酵过程都需要保持纯种培养，这就需要有一套能够适用于工业生产的灭菌技术。凡是与特定微生物接触的培养基、发酵罐、管路和通入的空气等均需要严格灭菌，以便进行纯种发酵。灭菌是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。如果发酵中染了杂菌，不只是杂菌消耗了营养物质，更重要的是杂菌分泌一些有毒副作用的物质，会抑制发酵菌生长，或严重改变培养液性质，或抑制产物生物合成；有的杂菌还会产生某种能破坏所需代谢产物的酶类。这种情况下，轻者影响产量，重者导致“全军覆没”。所以杂菌污染是对工业发酵的极大威胁，我们必须认真做好培养基、发酵设备、管道与附件的灭菌及空气除菌，严格控制生产操作的各个环节，杜绝杂菌污染。
工业生产上的灭菌方法很多，有加热灭菌、化学物质灭菌、射线灭菌等。化学物质灭菌和射线灭菌常用于无菌室、培养室、发酵车间等处的空气除菌。化学物质灭菌以甲醛、石炭酸、乳酸、漂白粉、硫磺、新洁尔灭、来苏尔等为主。射线灭菌主要指紫外线灭菌。加热灭菌分湿热灭菌和干热灭菌两种。目前发酵工业采用的灭菌方法主要是湿热灭菌，包括巴氏灭菌和高压蒸汽灭菌，其中又以高压蒸汽灭菌法应用最广。
高压蒸汽灭菌能有效地杀灭杂菌，但高温也破坏培养基的营养成分，因此必须了解高温杀灭微生物的原理与影响高温灭菌的因素，以便于选择最佳灭菌条件，达到既杀灭杂菌又尽量减少营养成分损失的目的。
本章主要阐述有关灭菌的基本理论和技术，旨在使读者能够较为系统地掌握和了解灭菌知识，用于指导生产实践。
所谓灭菌是指用化学的或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。而消毒仅是指用化学的或物理的方法杀灭或去除病原微生物的过程，它一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。用于工业规模和一般实验室规模的灭菌方法主要有热灭菌（包括湿热灭菌和干热灭菌）、化学物质灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等。
一、常用灭菌方法的基本原理
（一）化学物质灭菌
许多化学物质（如甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、氯化汞等）可用于消毒和防腐。这些药物易与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。生产中使用的培养基里含有的蛋白质等营养物质亦易与上述化学物质发生化学反应，同时药物加入培养基之后很难除掉。所以化学物质不适合用于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。
（二）辐射灭菌
辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。紫外线波长在240～300nm范围内（其中最有效波长是253.7nm），对微生物有高度致死效应，主要是与菌体核酸的光化学反应而造成菌体死亡。紫外线对营养细胞和芽孢均有杀灭作用，但穿透力很低，只适用于表面灭菌。用于灭菌的射线还有X射线、γ射线等，它们含有的能量极高（波长为0.01～0.14nm），被菌体吸收后，使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、过氧化氢和有机过氧化物。这些过氧化物能阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。X射线的致死效应与环境中还原性物质和含巯基化合物的存在密切相关。X射线的穿透力极强，因不经济，同时其辐射是从一点向四面八方放射，不适用于大生产。
（三）干热灭菌
干热灭菌是指在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增高的过程。干热对微生物有氧化、使细胞蛋白质变性和电解质浓缩等效应从而使微生物细胞中毒死亡，其中导致微生物死亡的主要作用是氧化。在干热处理下，只要有足够高的温度和足够长的时间，所有微生物都可被杀灭。
干热灭菌只适用于要求灭菌后物料能保持干燥状态的物品，如实验室规模的玻璃器皿等器具常采用干热灭菌。干热灭菌的温度和时间的关系。一般采用的干热灭菌的条件为160，120min。
微生物对干热的耐受力要比对湿热的耐受力强很多，这可用温度系数Q10即温度升高10时微生物的死亡速度常数与原来温度时的死亡速度常数的比值来表示。
（四）湿热灭菌
湿热灭菌是直接用饱和蒸汽进行灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在的情况下，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固变性，致使微生物在短时间内死亡。由于湿热灭菌有经济快速等特点，因此发酵工业中处理大量培养基时广泛采用湿热灭菌。
1.湿热灭菌的原理
一般微生物都有一个适合生长和维持生命活动的温度范围。当环境温度超过维持生命活动的最高限温度时，微生物就会死亡。杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。由于微生物的营养体、芽孢和孢子的结构不同，对热的抵抗力也不同。一般微生物营养菌体在60下保温10min即可被全部杀死，而芽孢在100下保温数十分钟乃至数小时才能被杀死。有些嗜热细菌在120下，可耐受20～30min。
2.理论灭菌时间的确定
各种灭菌方法都有使培养基营养成分遭到破坏的危险，但其程度受加热温度和时间影响。生产中要选择合适的灭菌温度和时间，以使培养基营养成分的破坏减至最低限度，又不含杂菌。
在灭菌过程中，微生物由于受到不利环境的影响，细胞蛋白质受热凝固，丧失活力，随时间延长而逐渐死亡，细胞个数逐渐减少，其减少速率与任何一瞬间残存的菌数（N）成正比。即杂菌在一定温度下，受热死亡遵循一级反应动力学的规律，这就是对数残留定律。
3.灭菌温度与反应速度常数的关系
微生物死亡的反应速度常数k与灭菌所采用的温度和微生物种类有关。k需用实验来确定。
4.实际灭菌时间的确定
从上式（4-4）可以看出，当NS=0时，t=∞，即灭菌后绝对无菌在实际工作中是不可能的。因此，工程设计时常采用NS=10-3（个/罐），即灭菌1000罐中只残留一个活菌数，可满足生产要求。
5.影响加热灭菌的因素
影响加热灭菌的因素很多，其中包括水分、脂肪、盐类、糖、pH、蛋白质、微生物含量、培养温度、微生物不同的生长阶段、灭菌的温度与时间等。因此，在具体加热灭菌时应考虑上述这些影响因素，适当地调整灭菌条件。在上述这些影响因素中，灭菌的温度与时间是最为重要的因素。
二、生产上培养基的灭菌方法
培养基灭菌过程中，除了微生物被杀死外，还伴随着培养基成分的破坏，尤其在蒸汽加压加热的情况下，氨基酸和维生素等都易被破坏。所以在工业生产中必须选择既能达到灭菌目的，又能将培养基中营养成分的破坏减少到最小的灭菌条件。
根据对数残留定律，灭菌过程中培养基受热破坏的化学反应为一级动力学反应。生产实践证明，灭菌温度较高而时间较短（高温短时）的灭菌效果要比灭菌温度较低而时间较长的好。目前在工业生产上通常采用的蒸汽灭菌有分批灭菌和连续灭菌两种方法。
（一）分批灭菌（又称实罐灭菌）
分批灭菌是先将输料管路内的污水放尽并冲洗干净，再将配制好的培养基用物料泵打到发酵罐、种子罐或补料罐内（较小体积的配料可直接在罐内配制），用直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。
1.分批灭菌的操作过程
（1）培养基预热 灭菌时培养基需先加热到80～90，然后再导入蒸汽升温到120～180.预热的目的一是防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温差过大而产生大量冷凝水使培养基稀释，二是防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。预热的方法是先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，等罐温升到80～90，将排气阀逐渐关小。
（2）培养基灭菌 将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接导入罐内（如有冲视镜管则也同时导入蒸汽），使罐温上升到120～130，罐压维持在1×105Pa（表压）左右，并保温30min。
2.分批灭菌的注意事项
①各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。
②排气量不宜过大，以节约蒸汽用量。
③灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。
④在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基（或物料）将倒流进入过滤器内。灭菌时总蒸汽压力不低于3.0×105～3.5×105Pa（表压），使用压力不低于2.0×105Pa（表压）。
（二）连续灭菌
连续灭菌即培养基在发酵罐外经过一套连续灭菌设备，以比分批灭菌高的温度和较短的时间进行快速连续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中。
1.连续灭菌流程
连续灭菌按加热和冷却方式不同可分为以下三种流程。
（1）此种连续灭菌流程是最常见的灭菌流程。待灭菌料液由连消泵送入连消塔底端，料液在此被加热蒸汽立即加热到灭菌温度，由顶部流出，进入维持罐。后经喷淋冷却器冷却到生产要求温度。灭菌时，要求培养基输入的压力与蒸汽总压力相接近，否则培养基的流速不稳定，影响培养基的灭菌质量。一般控制培养基输入连消塔的速度<；0.1m/min，温度为132，在塔内的停留时间为20～30s，再送入维持罐保温一定时间。
该连续灭菌系统的灭菌效果取决于培养基高温处理后送入维持罐内的维持时间。理论维持时间由式（4-4）求出。在生产实践中，一般维持5～8min。
（2）当料液经过渐缩喷嘴以高速喷出时，将蒸汽吸入与料液混合，迅速达到灭菌温度。
（3）培养基在设备中同时完成预热、加热灭菌、维持及冷却的过程。利用薄板换热器进行连续灭菌时，加热和冷却培养液所需的时间比使用喷射加热式连续灭菌稍长，但灭菌周期则较分批灭菌短得多。由于待灭菌培养液的预热过程同时为灭菌培养液的冷却过程，所以节约了加热蒸汽及冷却水。
2.连消塔式连续灭菌操作
（1）培养基预热 将料液预热到60～75，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。
（2）连续灭菌 连续灭菌是在连消塔中完成的。连消塔的主要作用是使高温蒸汽与料液迅速接触混合并使料液温度很快升高到灭菌温度。连续灭菌的温度一般以126～132为宜。
由于输送培养基的连消泵的出口压力一般为6×l05Pa，所以总蒸汽压力要求达到（4.5～5.0）×105Pa。只有当两者压力接近，培养基流速才能均匀稳定，否则流速非快即慢，影响灭菌质量。
（3）维持灭菌温度 由于连消塔加热时间较短，光靠这短时间的灭菌是不够的。因此，利用维持罐使料液在灭菌温度下保持5～8min，以达到灭菌的目的。维持罐的罐压一般维持在4×105Pa左右。
（三）冷却
生产上一般采用喷淋冷却，即用冷水在排管外由上向下喷淋，使管内料液逐渐冷却。一般料液冷却到40～50后，输送到预先灭过菌的罐内。在冷水喷淋前，冷却管内应充满料液。
连续灭菌的温度较高，时间较短，培养基受到的破坏较少，故质量较好；连续灭菌时由于培养液灭菌不在发酵罐内进行，所以发酵罐的利用率较高；此外，连续灭菌时蒸汽负荷均衡一致。连续灭菌的不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。
三、空罐灭菌与发酵附属设备及管路的灭菌
空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空罐灭菌一般维持罐压为（1.5～2.0）×105Pa，罐温为125～130，时间为30～45min。灭菌时要求总蒸汽压力不低于（3.0～3.5）×105Pa，使用压力不低于（2.5～3.0）×105Pa。灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。
发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。一般糖水罐灭菌时罐压为1×105Pa，时间为30min，油罐（消沫剂）的罐压为（1.5～1.8）×105Pa，时间为60min。灭菌时要使糖水翻腾良好，温度不宜过高，否则会造成糖损失。总空气过滤器灭菌时，先关闭总进气和出气阀门，开启放气阀门，使总空气过滤器内的压力降到零（表压）。总空气过滤器灭菌的蒸汽压力为3.5×105Pa左右，蒸汽自上端输入，上下放气口放气，总过滤器内压力控制为（1.5～2.0）×105Pa（表压），灭菌时间2h。灭菌完毕，自上端输入空气自上而下吹干过滤介质。
管道灭菌的蒸汽压力不应低于3.4×105Pa（表压），灭菌时间为1h。新安装的管道或长期未使用的管道灭菌时间可适当延长到1.5h，灭菌后以无菌空气保压，自然冷却30min即可交付使用。
四、固体培养基的灭菌
固体培养基的灭菌一般称为蒸料，蒸料是目前固态发酵酿造酱油和食醋中用得最广的一种方法。下面以酱油生产为例简要介绍蒸料的工艺和设备。
（一）蒸料的目的
①粉碎后的淀粉质原料吸水后膨胀，借助于蒸煮时的高温高压作用，使植物组织和细胞破裂，细胞中淀粉释放出来，淀粉由颗粒状态转变为溶胶状态（即原料中的淀粉达到糊化程度），并产生少量糖类供米曲霉生长利用。
②使原料中的蛋白质达到适度变性，易于被米曲霉发育生长所利用，并为以后酶分解提供基础。
③对原料进行灭菌。
（二）蒸料的要求
蒸料后熟料要求达到熟、软、疏松、不粘手、无夹心，产生熟料固有的色泽和香气。
（三）蒸料压力（温度）、蒸料时间与蛋白质变性和消化率之间的关系
蛋白质是由多种氨基酸组成的天然高分子化合物。原料在加热蒸煮过程中，因热力作用使蛋白质变性的程度与作用因素的强弱有关。若在一定的热力作用下，蛋白质的二、三、四级结构被破坏，严格的空间排列被打乱，而一级结构未发生变化，这种变性称为蛋白质的一次变性，也叫适度变性。若在更强烈的热力因素影响下，蛋白质进一步变性，称为二次变性或过度变性。完成一次变性的大豆蛋白质分子，由于维持其空间结构的键断裂，分子形状由球状变为纤维状，肽链松开，表面积增大，分子内的非极性基团暴露至外部，成为易被酶水解的状态。而过度变性的蛋白质则不能被酶水解，也不溶于酱油与食盐水中，降低了蛋白质的利用率。当曲料蒸煮时压力过大，或长时间蒸料并留锅后出料时，会发生过度变性现象。但若蒸煮不当，蛋白质未达适度变性，用这种蒸料制曲、酿酱，使未变性的蛋白质残留下来，将使成品酱油在稀释并加热时产生混浊和沉淀，生产上一般称此现象为酱油的N性，称此混浊和沉淀物为N性物质。这种物质不能被酶分解，人体也不能消化吸收，它的存在严重影响了酱油的质量。所以掌握好蒸煮条件，使蛋白质原料适度变性在原料预处理工序中是特别重要的。
蛋白质能否达到适度变性，与原料加水量、蒸煮时间、蒸煮压力（温度）有关。如日本人安田敦等将豆粕加水量在130%的条件下，经高温短时间蒸煮的饱和蒸汽压力和时间的关系做了试验。
AB曲线的左侧，为原料中残留的未变性蛋白质；CD曲线的右侧表示蛋白质的二次变性。在AB和CD两曲线之间区域表示蛋白质变性适度。同时还说明蒸煮压力越高，所需蒸料时间越短，时间控制范围越小，这就要求时间控制要精确；相反，在蒸煮压力稍低时，时间控制范围大，易掌握。安田敦还做了另一组试验，研究大豆原料在不同的蒸煮压力、不同时间蒸料后与酶解消化率的关系。
蒸煮压力高，时间短，原料蛋白质受酶作用的消化率就高，即蛋白质适度变性的比例就大，有利于提高原料的全氮利用率。
（四）蒸料冷却速度与消化率的关系
高温蒸料完毕，必须迅速降压冷却，以免原料继续受热，而使蛋白质过度变性。如安田敦等试验，将低温浸出脱脂大豆加水130%，蒸煮压力0.2MPa，蒸料时间为5min，控制不同的降压时间，结果消化率随着降压时间的延长而明显地降低。
（五）蒸料方法与设备
1.常压蒸料法
传统的常压蒸料是采用木质蒸桶或以钢筋水泥桶代替木桶，蒸汽管由蒸桶底部进入桶内，并使之均匀分布，桶顶为木质锅盖予以密闭。有更简易者，是将木桶架于铁锅上烧火蒸料。该方法设备较简陋，原料消化率和全氮利用率均较低，目前只有一些小型酿造厂采用。
常压蒸料较难将料蒸熟，为此要采取分层进料法。即先将水煮沸或开启蒸汽，把润水后的原料逐层均匀地撒入锅内。撒料时在面层冒蒸汽处再铺撒新一层原料，要求撒料松散，切忌进料太快和压实，以免出现局部生料。进料完毕，加盖蒸煮1～2h，停火或关汽，焖2～4h，出锅。
常压蒸料时，常采用熟料留锅法，即过夜出锅，以使熟料变成深红褐色为标准，这种方法易使蛋白质产生过度变性，色素的多量生成消耗了氨基酸和糖分，不仅损失了营养成分，而且对米曲霉产酶有阻碍作用。因此这种留锅法的蒸料技术，多已被淘汰或需要尽快改进。
2.加压蒸料法
目前所采用的加压蒸料设备主要有两种，即旋转式蒸煮锅和刮刀式蒸煮锅。
（1）旋转式蒸煮锅蒸料方法 曲料润水完毕，停止转锅旋转。开始蒸料时，先排除进气管内的冷凝水，以免通汽时发生局部原料水分太多而影响蒸料效果。开始时先用排气阀排出锅内空气，以防产生假压现象而降低蒸料温度和蒸料效果。待排气管连续喷出蒸汽时，关闭排气阀，使锅内压力升高。当压力升到0.03～0.05MPa时，再打开排气阀，使锅内冷空气排除干净，然后关闭排气阀，继续通入蒸汽使压力上升，当达到所要求的压力后，立即关闭进气阀。加压蒸煮的压力一般在0.08～0.14MPa，维持15～30min。在蒸料过程中转锅不断地作360°旋转。蒸料完毕，打开排气阀，先将压力泄掉，然后关闭排气阀，开动抽真空系统，形成真空蒸发，进行减压冷却，当品温逐渐下降到需要的温度时，即可出料。这种在锅内进行的冷却法，减少了杂菌污染的机会，有利于提高成曲质量，也有助于提高原料蛋白质利用率和酱油质量。
有的工厂采用长（豆粕润水时间长）、高（蒸料温度提高）、短（冷却时间缩短）的改良蒸料法后，使原料蛋白质利用率有所提高。
（2）刮刀式蒸煮锅蒸料方法 曲料润水完毕，用螺旋输送机装入蒸锅中，装锅时要缓慢而均匀，上料后2～5min，先开动刮刀0.5min，使原料平铺在锅底，然后开启蒸汽，由小到大，同时逐步连续进料，待原料装满锅，蒸汽开始从面层冒出时，加盖，加压至0.12MPa左右，保持15min，最后开启排气阀，放尽蒸汽即行出锅。
采用加压蒸煮锅蒸料时，必须注意以下几点：
①受压容器要经常检查，压力不应超出规定范围，确保安全。
②操作时要严格遵守操作规程。
③出料时锅内残余蒸汽必须排尽。
④装卸锅盖时，应对称上紧螺栓，使各螺栓及锅盖承受比较均匀的压力。
五、膜技术的应用
膜技术在食品与发酵工业中的应用始于20世纪60年代末，首先是从乳品加工和啤酒无菌过滤开始，随后逐渐用于果汁、饮料、酒类等方面。
利用微孔滤膜技术生产生啤酒，是在常温条件下把啤酒中的残留酵母菌和污染菌分离除去，此技术可代替高温瞬时杀菌和巴氏灭菌，保持了生啤酒原有的风味。从经济的角度来看，其运行费用接近甚至低于高温瞬时杀菌和巴氏灭菌，而且节能、省时。所以美、德、日等发达国家早在20世纪80年代初就采用了微孔滤膜过滤技术来生产生啤酒。目前，应用微孔滤膜过滤技术生产生啤酒在国际上已相当普遍。我国在这方面起步较晚，但近年来用该技术生产生鲜啤酒，也逐渐成为一种趋势。
微孔滤膜过滤技术在生鲜啤酒生产中的应用优势主要体现在以下两个方面：
①改革传统的过滤工艺：传统的过滤工艺是发酵液经硅藻土粗过滤后再经纸板精滤。膜过滤可用来替代纸板精滤，且过滤效果更好，过滤后酒的质量更高。
②改善无菌水和CO2的质量：夏、秋两季啤酒需求量特别大，不少厂家采用高浓度发酵液的后稀释法来扩大产量。用来稀释啤酒所必需的无菌水及CO2气体质量的高低直接影响啤酒的风味及其稳定性。因此，应根据实际需要选择相应的分离方式对水和CO2进行处理。我国啤酒厂生产所需CO2通常直接从发酵罐中回收，压成“干冰”后再使用，几乎没有经过处理，杂质含量高。后稀释所需的无菌水常用普通的深层过滤，较难达到无菌的要求。微孔滤膜过滤技术能去除水中的悬浮物、固体颗粒、细菌等杂物，结合活性炭吸附和紫外线消毒技术可将水处理成无菌水。经膜过滤器处理过的水，其大肠杆菌数和各类杂菌已基本去除，CO2气体经膜过滤器处理后，纯度可达到95%以上。
微孔滤膜技术在生啤酒生产中的工艺流程如下所示：
硅藻土过滤→3μm膜过滤→清酒罐→1μm膜过滤→0.45μm或0.22μm膜过滤→无菌灌装微孔滤膜技术对啤酒生产用水的处理工艺流程如下所示：
原水→5μm膜过滤→活性炭吸附→1μm膜过滤→0.22μm终端膜过滤→紫外线杀菌→无菌水
