第一节 主要药效学试验中的动物实验方法
药品是一种特殊的商品，它的质量及正确使用直接关系到人民群众的健康。新药研究是指从发现到批准投产上市，从药学、药理学、毒理学和临床医学等各方面的系统研究过程。新药研究目的是保证安全、有效、优质、稳定的药物上市，为人民健康服务。加强对新药研究全过程的认识，以严肃、严密和严格的精神从事新药研究工作，是加强药品管理、保证药品质量，保障人民群众用药及时、方便、安全、有效，维护人民群众身体健康有重大意义，而且对保持社会稳定和经济建设顺利进行也有重大作用。
目前，国内从事药物研究的机构、人员众多，质量良莠不齐。为加强药物研究的监督管理，规范药物研究行为，保证药品申报注册资料的真实、可靠，国家药品食品监督管理局特制定了法规，规定了从事药物研究必须具备的条件。
1.从事药物研究的机构应具有与药物研究项目相适应的人员、场地、设备、仪器和管理制度；研究机构的有关管理人员和专业人员应具备所从事药物研究的专业知识和经验，并熟悉和遵守相关的法律、法规和技术要求。药物研究的机构必须配备与所承担研究内容相适应的组织管理机构，保证试验数据与资料的真实性和可靠性。
2.委托其他单位进行药物研究，受托方应当具备相应的条件，双方应有委托合同或其他有效证明。委托方应当对申报资料中的药物研究数据的真实性负责。
3.从事药物临床前研究的单位应当按照《药物研究机构备案管理办法》向所在地省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局）备案。
4.从事药物非临床安全性评价研究机构必须通过国家《药物非临床研究质量管理规范》认证，开展药物非临床安全性评价研究必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。
5.从事药物临床试验的医疗机构须通过国家药物临床试验机构资格认定，开展药物临床试验必须执行《药物临床试验质量管理规范》。
6.药物研究应当参照国家食品药品监督管理局发布的有关技术要求或指导原则进行。申办者采用其他的评价方法和技术方法进行试验的，应具有能证明其科学性的资料。
一、主要药效学研究方法
1.新药的主要药效学作用应当用体内外2种以上实验方法获得证明，其中一种必须是整体的正常动物或模型动物。
2.实验模型必须能反应药理作用本质，如果有些新药确实无法满足上述动物的模型要求，应充分说明理由，改用其他模型。
3.指标应能反映主要药效学作用的药理本质，客观可靠，能定量或半定量。
4.剂量应做出量效关系，尽量求出ED50或有效剂量范围，量效关系不明确的药物应说明原因。
5.给药方法应采用拟推荐临床用的给药方法，如该法在动物身上无法实施，应予说明，改用其他方法。
6.对照空白对照组、阳性药物对照组、模型对照组、药效至少3个剂量组。
二、动物选择及模型建立
（一）动物选择
动物的质量与药效关系非常密切。不同种动物对药效有不同的影响；同种动物不同品系对药效也有影响；此外，动物的年龄、性别等也与药效有关。选择动物总的原则如下。
1.动物选择依据首先，选择的动物必须是健康、符合实验动物管理要求的动物，根据不同的实验要求选择不同等级的动物实验。其次，动物的年龄、性别应该是合适的。一般实验常用成年动物。但观察药物对生长、发育、内分泌等系统的作用时，则以幼年动物为好。而观察药物的抗衰老作用时，则要用老年动物或衰老过程较快的专用模型动物。一般实验用雌雄各半动物，但进行致畸实验及对雌性生殖系统作用的药物就要用雌性动物。有些特殊实验要选用单性别动物，如壮阳药、男性抗生育药要用雄性动物，而热板法镇痛实验则选用雌性动物。
2.注意种属异同性动物和人对药物的反应既有共同性，又有差异性。正确认识这些异同性，对评价药效学有重要意义。因为有共同性，动物实验结果对推论临床情况才有意义。但差异性也是常见现象，必须要有充分的估计。不仅动物与人之间有差异性，不同种属动物甚至同一种属的不同品系之间对药物的反应，有时也有明显的差异。
归纳起来，选择动物时应尽可能选用与人在生物学上接近，在机体解剖、生理功能相类似的动物，应选用敏感动物品系，选用靶器官高效应实验动物。同时，注意动物的年龄、性别、遗传、营养、环境等因素。
（二）模型建立
病理模型动物是一类具有重要研究价值和特定意义的研究材料。动物病理模型可以是自然产生的，也可以是人工制备的能够反映人类疾病的动物病理模型。实验动物模型的应用，为药物研究提供了十分重要的手段。药效学试验要选用合适的动物模型。
药效学试验动物模型的建立，一般有3种情况：①动物模型的治疗结果与人体使用结果基本相同，如抗感染动物模型、小鼠镇痛模型、豚鼠过敏性哮喘模型等。②无合适或不大好建立的模型，前者如银屑病、秃发、颈椎病、骨质增生、痔疮、红斑狼疮和视网膜炎等，可采用一些间接指标，如改善皮肤微循环，测量毛发生长速度、数量与弹性，测定皮肤胶原蛋白含量及观察眼结膜的微循环等；后者如癫痫、慢性萎缩性胃炎等，虽然也评选了一些药物，但与人体相比，在病原及病理上还有相当差距，需要经过多种方法验证，特别是临床验证后才能肯定。③有些疾病模型迄今无法建立，如神经官能症、精神病、眩晕症、四肢麻木、夜尿和幻觉等。总之，对药理作用要具体分析，大量查阅文献，结合客观实际进行药效学动物模型的试验设计。
药效学动物模型，一般来说，以整体动物为好。我国药效学指导原则指出，至少有一种整体动物模型。但也并非不能用离体试验模型，只要特异性好，能反映药理作用的本质就行。如青蛙坐骨神经腓肠肌标本可用做横纹肌松弛药的药效学评选，蛤蜊的离体心脏可用做评选吲哚类化合物，甚至很多昆虫和植物也可作为药效评选模型。如蝗虫的腿可评选神经肌肉接头的药物，果蝇可评选抗衰老药物。这些方法用的合适，可节省不少的人力和物力。
要注意整体动物模型和各种体外模型的药理反应之间的差别。如很多简单的酚化物和芳香胺在体外百分之几的浓度就能抑制结核杆菌的生长，而在体内无效。疟原虫虽有体外和体内2种方法，但主要是靠体内。很多药物体外过筛很有效，而在体内无效。
因此，不同动物模型对药效评选的不同结果给新药评价工作带来不小的困难。建立模型应根据人体发病机制来建立，一定要在体内和体外、动物和人体的各方面效应之间不断验证。一个药效评价往往需要几个模型，且在评价工作的不同阶段反复进行，切忌单凭个别动物指标就做出是与否的结论。
第二节 药物临床前安全性评价的意义和局限性
一、临床前安全性评价的意义
为了提高新药的安全性，保证人民群众用药安全，新药审批中非常强调药物安全性评价。通过药物临床前安全性评价，提供新药对人类健康危害程度的科学依据，预测上市新药对人体健康的有害程度，淘汰危害大的，权衡有危害的，通过危害小的、没有危害的新药，使新药成为人类同疾病作斗争的有力武器。
临床前安全性评价是依靠药物毒理学的研究方法和手段来进行的。药物毒理学的目的是观察和测定化学物质对机体引起的损害，发病机制以及对机体全身的影响而进行的实验研究。其中，毒性病理学的研究可为药物的安全性提供重要的依据。在毒理学研究中大部分试验要进行动物实验，无论是急性毒性试验、长期毒性试验、致畸试验、致癌试验等病变的发现，部位的确定，病因的探索都离不开毒性病理学的检查和诊断。
二、动物毒性试验评价的局限性
新药临床前安全性评价意义重大，但又有一定的局限性。它的正确性受多种因素影响，有的是无法克服的。WHO在《临床前药物安全试验原则》一书中指出：“虽然事前对生物活性物质进行了最细致彻底的科学研究，但给人用时总是不可避免的冒一定的风险”。原因主要有二：一是新药本身；二是来自现有毒理学评价手段。新药不断改变的化学结构和由之产生的毒理学特征，总不同于已有的老药，因此也往往超出人们原有的知识、经验和评价手段所达到的预测能力。现有的临床前评价手段（主要是动物毒性试验）也未必完全适应新药评价的需要，动物试验还存在着许多缺点。
1.实验动物和人对药物反应的种属性差异有的反应只出现于动物，有的反应只出现于人，动物与人共同出现的反应仅占一部分。据Fletcher估算，动物和人共同的反应平均仅占一个药总反应的25%左右。这是一种笼统的、平均的概念，很可能就某种药来说，人与动物的共同反应占很高的比率，而对另一种药来说共同反应可能占很小的比率。
2.实验动物的数量有限一些发生率低的毒性反应，在少量的动物中难以发现。用数量巨大的动物做试验，显然是不可能的。而新药上临床后，出现某种发生率很低却又非常严重的毒性反应的例子并不少见。
人体毒性作用发生率（%）动物数*（0.95概率）10015052014102955912990.129950.0129956*至少发现一只动物产生毒性反应（假设人和动物对药物的毒性反应的发生率相同）。
3.实验动物的反应单一常规毒性试验所用的动物多为实验室培育的品种，反应较单一，而临床病人广泛，对药物的敏感性各不相同，有可能对某种药物出现特异性反应。
4.实验动物与人的生理状态差异毒性试验所用的动物多是健康的，而临床用药的病人可能同时患有多种疾病；其中一种疾病的存在往往是发生某种毒性反应的重要前提。
5.试验剂量与临床剂量的差异动物毒性试验中常采用大剂量给药，尤其是那些毒性低、给药量很大的药，有时会给试验结果造成假象。如乳糖的大剂量长期毒性试验会导致钙性肾病，原因在于乳糖剂量过大，超过了小肠的水解吸收能力，使大量乳糖残留于肠内，引起肠道细菌发酵，导致腹泻、失水、失钠，使肾小管代偿性地增加对钙钠的重吸收，久之引起钙性肾病。
临床前安全性评价的预测能力并不是停留在一种固定水平，而是在不断的提高。在新药临床前安全性评价的发展史上，有许多成功的例子。如致癌、致畸、生殖及三代生殖试验等的试验方法和模型的建立；又如过敏反应的动物模型——豚鼠的建立；再如氨基葡萄糖苷类抗生素耳损伤的动物模型的筛选。通过上述方法和模型的建立，大大提高了动物实验中对这些药物毒副反应的预测能力，相信随着医药科学的发展，新药临床前安全性的评价和预测能力将得到巨大的提高。
三、安全性评价的基本要求
新药安全性评价的目的是确保临床用药的安全，一个优良的临床前安全性评价结果必须能达到以下目标。
1.找出毒性剂量不仅要测出急性毒性的LD50，使我们粗浅了解该药单次给药的毒性剂量，还要了解连续长期给药产生毒性的剂量。
2.确保安全剂量范围找出单次或多次给药的有效范围，而且不产生毒性和不良反应，安全范围越大，则作用越好。
3.发现毒性反应通过动物的毒性反应症状为临床用药的安全性监护提供依据，一旦发生便可及时采取措施。
4.毒性靶器官的寻找找出药物作用的毒性靶器官，为药物毒性防治提供依据。
5.毒性的可逆与否看动物出现的毒性反应能否恢复。一般来讲，可逆性毒性反应不影响新药审批，如有不可逆损伤，则一般不批准上临床。
6.解救措施毒性作用强而猛、安全范围小的药物，必须有相应解救措施，特别是注射剂类，更应注意。
第三节 急性毒性试验中的动物实验方法
急性毒性试验（acute toxicity test）是研究动物一次或24h内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应。急性毒性试验处于药物毒理研究的早期阶段，作用在于：①阐明药物的毒性作用和其毒性靶器官；②为长期毒性试验剂量和药物Ⅰ期临床试验起始剂量的提供剂量依据；③提供一些人类药物过量急性中毒相关的信息。
一、动物实验方法
1.受试物受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。
2.动物至少采用2种哺乳动物，一般选用一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物。啮齿类用小鼠或大鼠，非啮齿类用犬（杂种犬或Beagle犬）或其他动物。根据试验目的及受试物的特点，确定实验动物的性别和年龄等。通常采用健康成年动物，动物雌雄各半。如果受试物拟用于儿童或可能用于儿童，建议必要时采用幼年动物进行试验。动物初始体重差异在平均体重20%以内。动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。
3.剂量和分组给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性（危及生命的）剂量，同时设空白和（或）溶媒（辅料）对照组。小动物一般分4～6个剂量，大动物一般用6只犬。
4.给药途径给药途径包括临床拟用途径和一种能使原形药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。经口给药前动物一般应进行一段时间（通常一夜）的禁食，不禁水。
5.观察时间及指标给药后，一般连续观察至少14天，给药当天，尤其是给药4h内应严密观察，然后每天上、下午各一次。观察毒性反应出现的时间及其恢复时间、动物死亡时间等。观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等。
6.病理学检查所有的实验动物均应进行大体解剖，包括试验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活的动物。任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均应记录并进行组织病理学检查。
二、结果处理和分析
根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。对结果归纳分析，判断每种反应的剂量——反应及时间——反应关系。
判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统等。
根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。组织病理学检查应附有病变组织的病理照片。
根据各种毒性反应及发生率、动物死亡情况等，采用适当的试验方法来测定最大无毒性反应剂量或最小毒性反应剂量，最大耐受剂量或近似致死量或最小致死剂量等，初步判断受试物的安全范围。
急性毒性试验中常用实验方法如下。
（一）近似致死剂量法
该方法主要用于非啮齿类的动物实验。一般采用6只健康的Beagle犬或猴。犬的年龄一般为4～6个月龄，猴的年龄一般为2～3岁。
根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其他有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。
（二）最大给药量法
对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或24h内多次给药（剂量一般不超过5g/kg体重），观察动物出现的反应。一般使用10～20只动物，连续观察14天。
（三）固定剂量法
该方法不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。试验选择5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg和2000mg/kg 4个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加5000mg/kg剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食6～12h，给受试物后再禁食3～4h。采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试验。从上述4个剂量中选择一个作为初始剂量；一般用500mg/kg作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg进行预试验，此剂量如无死亡发生即可结束预试验。如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此2个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试验一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24h。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，应继续观察7天。
在上述预试验的基础上进行正式试验。每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据预试验的结果，在上述4种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验。给受试物后至少应观察2周，根据毒性反应的具体特点可适当延长观察时间。
（四）上下法
该法最大的特点是节省实验动物，同时可以进行毒性症状的观察、估算LD50及其可信限，适合能引起动物快速死亡的药物。该方法分为限度试验和主试验。限度试验主要用于有资料提示受试物毒性可能较小的情况。在相关毒性资料很少或没有时，或预期受试物有毒性时，应进行主试验。
1.限度试验最多用5只动物进行的序列试验。试验剂量为2000mg/kg，特殊情况下也可使用5000mg/kg。
（1）2000mg/kg剂量水平的限度试验将受试物给予1只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，依次将受试物给予另外4只动物，如果有3只动物死亡，则进行主试验。
（2）5000mg/kg剂量水平的限度试验特殊情况下，可使用5000mg/kg的剂量。将受试物给予1只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，将受试物给予另外2只动物。如果这2只动物都存活，则LD50大于5000mg/kg，停止试验（即不再对其他动物给药，观察14天）。如果这2只动物中有1只死亡或者2只均死亡，将受试物给予另外2只动物，一次1只。如果1只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价。有3只或3只以上动物死亡时，LD50小于5000mg/kg；有3只或3只以上动物存活时，LD50大于5000mg/kg。
2.主试验由一个设定的给药程序组成，在此程序中，每次给药1只动物，间隔至少48h。给药间隔取决于毒性出现时间、持续时间和毒性的严重程度。在确信前一只动物给药后能存活之前，应推迟按下一剂量给药。时间间隔可以适当调整，但使用单一时间间隔时，试验会更简便。
第一只动物的给药剂量低于LD50的最接近的估计值。如果该动物存活，第二只动物给予高一级剂量；如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。剂量级数因子应选定为1/（剂量-反应曲线斜率估计值）的反对数（对应于斜率2的级数因子为3.2），并应在整个试验过程中保持不变。当没有受试物的斜率的有关资料时，使用3.2为剂量级数因子。使用默认级数因子时，剂量应从以下序列中选择：1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、2000mg/kg（或有特殊要求时1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、1750mg/kg、5000mg/kg）。如果没有受试物的致死估计值，应该从175mg/kg开始。如果预期动物对该受试物的耐受程度变化很大（即，估计斜率小于2.0），那么开始试验前应考虑增加剂量级数因子超过按对数剂量计算的默认值0.5（即，级数因子为3.2）。同样，对于已知斜率很陡的受试物，应选择小于默认值的级数因子。
在决定是否及如何对下一只动物给药之前，每只动物都应认真观察48h。当满足停止试验标准之一时，停止给药，同时根据终止时所有动物的状态计算LD50估计值和可信区间。用最大可能性法计算LD50值。
当满足下列停止试验标准之一时，停止试验：连续3只动物存活；任意连续6只实验动物中有5只连续发生存活/死亡转换；第一只动物发生转换之后至少有4只动物进入试验，并且其LD50估算值的范围超出临界值（2.5倍）（首次转换的第4只动物之后，对每次给药进行计算）。对于LD50和斜率的各种组合，在动物发生死亡/存活转换之后，用4～6只动物即可满足停止试验标准。但在一些情况下，化合物的剂量-反应曲线的斜率较小，可能另外还需要增加动物（总共可达15只）。
（五）累积剂量设计法
在非啮齿类动物进行急性毒性试验可采用累积剂量设计法。经典的试验设计需要8只动物，分对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。
剂量的设计可以是1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg、300mg/kg、1000mg/kg、3000mg/kg，也可以采用10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg、640mg/kg、1280mg/kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。
当没有动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或受限制剂量。当在某一剂量所有动物均出现死亡时，MLD和LD50应在最后2个剂量之间。当在某一剂量部分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD50则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间。假如没有动物死亡发生，常以最高剂量给予动物5～7天，以确定后续的重复给药试验中高剂量的选择。
（六）半数致死量法
半数致死量法是一种经典的急性毒性试验方法，试验结果经统计学处理可获得受试物的LD50.
第四节 长期毒性试验中的动物实验方法
长期毒性试验（重复给药毒性试验）是指反复多次给药予动物，观察药物对动物的毒性反应，一般指连续给药14天以上。长期毒性试验是药物非临床安全性评价的核心内容，是药物从药学研究进入临床试验的重要环节。长期毒性试验的目的包括以下5个方面：①预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、剂量——反应关系和时间——反应关系、可逆性等；②判断受试物反复给药的毒性靶器官或靶组织；③推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；④提示临床试验中需重点监测的指标；⑤为临床试验中的解毒或解救措施提供参考。
一、动物实验方法
1.受试物采用制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应注明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。
2.实验动物采用2种实验动物进行试验，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类。常选择大鼠和Beagle犬或猴。动物年龄应尽量一致，一般大鼠为6～9周龄，Beagle犬为6～12月龄。每个试验组使用相等数量的雌、雄动物，一般大鼠为雌、雄各10～30只，Beagle犬或猴为雌、雄各3～6只。
动物选择正常、健康和未孕的动物，动物体重差异不超过平均体重的20%。动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。
3.给药方案至少设高、中、低3个剂量给药组、一个溶媒（或辅料）对照组，一个空白对照组和一个阳性对照组。给药途径应与临床用药途径一致。原则上动物应每天给药，给药期限长（3个月或以上）的药物每周至少给药6天。
二、结果处理和分析
试验前，啮齿类动物应进行至少5天的适应性观察，非啮齿类动物至少应驯养观察1～2周，非啮齿类动物还至少应进行2次体温、心电图、血液学和血液生化学指标等的检测。
试验期间，对动物进行外观体征、行为活动、摄食量、体重、粪便性状、给药局部反应、血液学指标、血液生化学指标等的观测。非啮齿类动物还应进行体温、心电图、眼科检查和尿液分析。
给药结束后，应对动物（除恢复期观察动物）进行全面的大体解剖，主要脏器应称重并计算脏器系数。如发现有异常变化，应附有相应的组织病理学照片。非啮齿类动物对照组和各给药组主要脏器组织均应进行组织病理学检查；啮齿类动物对照组和高剂量给药组动物，以及尸检异常者应详细检查，如某一组织发生病理改变，其他剂量组动物该组织也应进行组织病理学检查。
应在给药结束后对部分动物进行恢复期观察，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。长期毒性试验必须检测的指标如下。
1.应检测的血液学指标红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、网织红细胞计数、白细胞计数及其分类、血小板计数、凝血酶原时间。
2.应检测的血液生化学指标天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、碱性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、γ-谷氨酰转移酶（非啮齿类动物）、钾离子浓度、氯离子浓度、钠离子浓度。
3.应检测的尿液分析指标尿液外观、比重、pH值、尿糖、尿蛋白、尿胆红素、尿胆原、酮体、潜血、白细胞。
4.需称重并计算脏器系数的器官脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、睾丸、附睾、卵巢、子宫、肺脏。
5.需进行组织病理学检查的组织或器官脑（大脑、小脑、脑干）、脊髓（颈、胸、腰段）、垂体、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、小肠和大肠、肝脏、胆囊、肾脏、肾上腺、脾脏、胰腺、气管、肺、主动脉、心脏、附睾、睾丸、卵巢、子宫、前列腺、乳腺、坐骨神经、膀胱、眼（眼科检查发现异常时、视神经、给药局部）骨髓、淋巴结（给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结）。注：为啮齿类动物可不进行组织病理学检查的组织或器官。
第五节 安全药理学试验中的动物实验方法
安全药理学（safety pharmacology）主要是研究药物在治疗范围内或治疗范围以上的剂量时，不期望出现的对生理功能的不良影响，即观察药物对中枢神经系统、血管系统和呼吸系统的影响。其目的是：确定药物可能关系到人的安全性的非期望药理作用；评价药物在毒理学和（或）临床研究中所观察到的药物不良反应和（或）病理生理作用；研究所观察到的和（或）推测的药物不良反应机制。
一、动物实验方法
1.受试物受试物应与药效学或毒理学研究的一致，外用药物和注射剂一般以制剂作为受试物，并附研制单位的自检报告。
2.实验动物常用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬等动物。小动物每组不少于10只，大动物每组不少于6只。动物雌雄各半。动物选择与试验方法相匹配，同时还应注意品系、性别及年龄等因素。尽量采用清醒动物。如使用麻醉动物，应注意麻醉药物的选择和麻醉深度的控制。
3.对照一般可选用溶媒和（或）辅料做对照、阳性对照组。
4.剂量剂量应包括或超过主要药效学的有效剂量或治疗范围。如果缺乏不良反应的结果，试验的最高剂量应设定为相似给药途径和给药时间的其他毒理试验中产生中等强度不良反应的剂量。在安全药理学的检测指标未产生不良反应时，在限制剂量的情况下，可以采用单一剂量。体外研究应确定受试物的浓度——效应关系。
5.给药途径与次数一般采用单次给药。采用与临床拟用途径一致的给药途径。如果有多个临床拟用途径时，分别采用相应的给药途径。
6.观察时间结合受试物的药效学和药代动力学特性、受试动物、临床研究方案等因素选择观察时间点和观察时间。
二、主要研究内容
（一）核心组合试验
核心组合试验的目的是研究受试物对重要生命功能的影响，即对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统重要器官系统的影响。
1.中枢神经系统定性和定量评价给药后动物的运动功能、行为改变、协调功能、感觉/运动反射和体温等的变化。
2.心血管系统测定给药前后血压（收缩压、舒张压和平均压）、心电图（QT间期、PR间期、S-T段和QRS波等）和心率等的变化。
3.呼吸系统测定给药前后动物的呼吸频率和呼吸深度等的变化。
（二）追加和（或）补充的安全药理试验
当核心组合试验、临床试验、流行病学、体内外试验以及文献报道提示药物存在潜在的与人体安全性有关的不良反应时，应进行追加和（或）补充的安全药理学研究。
1.追加的安全药理学试验
（1）中枢神经系统行为、学习记忆、神经生化、视觉、听觉和（或）电生理等指标。
（2）心血管系统心输出量、心肌收缩作用、血管阻力等指标。
（3）呼吸系统气道阻力、肺动脉压力、血气分析等指标。
2.补充的安全药理学试验
（1）泌尿/肾脏系统观察药物对肾功能的影响，如尿量、密度、渗透压、pH值、电解质平衡、蛋白质、细胞和血生化（如尿素氮、肌酐、蛋白质）等指标。
（2）自主神经系统观察药物对自主神经系统的影响，如与自主神经系统有关受体的结合、体内或体外对激动剂或拮抗剂的功能反应、对自主神经的直接刺激作用和对心血管反应、压力反射和心率等指标。
（3）胃肠系统观察药物对胃肠系统的影响，如胃液分泌量和pH值、胃肠损伤、胆汁分泌、体内转运时间、体外回肠收缩等指标。
三、数据处理与结果评价
选用合适的统计方法，对数据进行定性和定量分析。同时结合药效、毒理、药代动力学以及其他研究资料进行综合评价，为临床研究提供参考。
第六节 生殖毒性试验中的动物实验方法
生殖毒性试验（reproduction toxicity study）是通过动物实验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖功能的不良影响，以及对子代胚胎——胎仔发育、出生后发育的不良影响。
一、动物实验方法
（一）受试物
受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。
（二）实验动物
采用与其他毒理学试验相同种属和品系的哺乳动物进行试验。啮齿类动物首选大鼠，非啮齿类动物首选家兔。选用年轻、性成熟的成年动物，雌性动物未经产。动物初始体重差异在平均体重20%以内。动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。
（三）动物分组
1.一般生殖毒性试验动物分组至少设2个剂量组，以及1个溶剂对照组和1个阳性对照组（必要时）。每组雄性动物20只，雌性动物20只以上。
2.致畸敏感期毒性试验动物分组设立3个剂量组，1个溶剂对照组（必要时）、1个空白对照组和1个阳性对照组，各组的雌鼠数依据研究需要和已查到阴道栓的雌鼠数确定，为保证每组孕鼠达到20只以上，一般每组准备30只雌鼠，15只雄鼠用于交配。家兔每组雄性10只，雌性20只用于交配（或人工授精），以保证得到足够的孕兔。
3.围生期毒性试验动物分组设高、中、低3个剂量组，1个溶剂对照组、1个阳性对照组（必要时）、1个空白对照组（必要时）每组需雄鼠15只，雌鼠30只或雄兔10只，雌兔20只。
（四）给药方法
1.给药途径原则上与推荐临床应用的给药途径相同。但致畸敏感期毒性试验不宜采用腹腔注射，口服制剂除灌胃外，还可在严格测定其消耗量的前提下自由摄取或在饮水、饲料中投入。
2.给药时间一般生殖毒性试验，在交配前雄28～80天，雌性14天，连续给药。雌性动物交配后继续给药至多数器官形成期；致畸敏感期毒性试验，于胚胎器官形成期连续给药，大鼠孕后6～15天，小鼠5～15天，家兔6～18天；围产期毒性试验，大鼠和小鼠于妊娠第15天开始给药，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠）。家兔于妊娠期第22天开始给药，至分娩后31天。
3.给药体积各种动物一次灌胃能耐受的最大容积和不同途径给药的常用注射量。
（五）观察指标
1.给药期间一般状态观察给药期应检查每只动物出现的各种毒性迹象，如活动抑制、嗜眠症、旋转等行为异常及腹泻，粪便、尿液或分泌物中带血，或其颜色改变，肿胀、肿块、损伤、皮毛粗糙、眼睛分泌物多、动物体重减轻等现象。给药后一般观察1～2h。
2.一般生殖毒性试验观察指标
（1）雌鼠饮水量、食物耗量、死亡数及一般健康情况。每周称体重一次、观察交配行为，计算受孕率等。
（2）雄鼠给药期间饮水量、食物耗量、体重变化情况；交配后处死、取附睾精子进行精子活动度、精子计数和精子形态观察；称睾丸、附睾重量，计算重量系数、生育率等；睾丸组织送病理检查。
（3）孕鼠分别在妊娠第0、6、12和18天称体重，第14天每组处死10只，检查统计受孕率、着床前死亡率、着床后死亡率等。
（4）仔鼠出生后24h内，计算死、活仔鼠数；称体重，观察性别比例及外观畸形；第4天时剔除多余仔鼠，使各窝仔鼠数等于8，少于6只仔鼠的窝弃之不用。第0、4、7、14、21、28和35天称重，记录仔鼠生存情况；断乳时处死，解剖检查内脏畸形。
3.致畸胎试验观察指标一般观察指标包括黄体、着床数、胎块、晚死胎、活胎、母体增重等。
（1）胎仔的外观检查观察有无脑积水、露脑、脑膜膨出、无眼、小眼、无耳、腭裂等头部畸形。有无多趾、并趾、无趾、足内翻、短肢等四肢畸形。有无脐疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂、脊柱侧突等躯干畸形。有无短尾、卷尾、无尾、尾分叉等尾畸形，有无肛门闭锁等。
（2）骨骼检查观察头颅是否完整，骨化程度；有无胸骨节缺失、骨化不全、双骨化点、胸骨节错位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波状肋等。有无四肢骨化不全、粗短、畸形、多趾（指）、少趾（指）等。
（3）器官检查观察有无腭裂、舌异常；有无鼻道扩大、单鼻道等。眼球大小是否正常，有无脑水肿、肾积水等；心、肝、脾、肺、肾、子宫、睾丸等脏器大小位置等有无异常。
4.围生期毒性试验观察指标
（1）母鼠体重、饮水量、摄食量、妊娠分娩时间、产仔数、受孕率、死亡率等。
（2）仔鼠外观畸形、幼仔出生存活率、哺育成活率、性别比例、生长指数等；断乳时处死检查心、肺、肝、脾、肾、睾丸或子宫的重量及内脏畸形。
（3）仔鼠生育发育和断乳前神经行为发育测试指标。
生理发育指标出生后时间（天）神经发育指标出生后时间（天）耳郭分离1～平面翻正2～出毛3～运动状况4～门齿萌出6～负趋地性5～张耳6～悬崖回避5～睁眼10～触须定位10～睾丸下降20～空中翻正13～阴道张开30～视觉定位15～
（4）仔鼠断乳后行为测试指标①光电活动笼测试，记录F1小鼠自发活动次数；②转棒试验，检测F1小鼠协调运动功能；③游泳衰竭时间测试，观察低温情况下F1仔鼠被动运动能力；④“Y”形迷宫测试，检测F1小鼠学习记忆能力；⑤生殖行为试验，了解F1小鼠交配行为及受孕率。
二、结果分析和评价
（一）一般生殖毒性试验统计指标及数据处理
一般生殖毒性试验统计指标包括如下内容。
1.雌鼠实验动物数、饮水量、食物消耗量、死亡动物数、体重（每周称一次）、受孕率等。同时注意观察雌鼠一般健康情况和交配行为等。
2.雄鼠实验动物数、饮水量、食物消耗量、死亡动物数、体重（每周称一次）、生育率。必要时检查精子活力、精子数量、精子畸形率、睾丸（附睾）重量、睾丸（附睾）重量系数、睾丸病理检查结果。
3.孕鼠体重、妊娠率、着床前死亡率、着床后死亡率、平均着床数。
4.仔鼠死仔鼠数、活仔鼠数、仔鼠总数、性别比例、外观畸形仔鼠数、外观畸形率、体重（分别在第0、4、7、14、21、35天时称）。仔鼠哺乳期存活情况、断乳时内脏检查。
5.数据统计处理方法受孕率、生育率、胎鼠畸形率、胎鼠性别等计数资料用χ2检验；体重等计量资料用t检验；着床前死亡率或以着床数为单位的死胎率作反正弦变化后进行t检验；各组胎鼠平均体重用方差分析，若各组均数间差别有显著性，进一步用Dunnett 检验分析；精子畸形率以等级秩和检验统计处理。各组试验仔鼠断乳前以窝为单位统计，断乳后以个体单位统计。
（二）致畸敏感期毒性试验的统计指标及数据处理
1.对各组母动物需统计的指标
（1）实验动物数。
（2）交配成功动物数及交配率。
（3）死亡动物数及死亡率。
（4）剖检母动物数：①剖检母动物的平均体重及孕期体重增长值或母体增重；②平均妊娠黄体数；③平均着床数；④有畸胎的动物数及畸胎率。
2.各组胎仔需统计的指标平均活胎数及活胎率、吸收胎数和吸收胎率、死胎数和死胎率、性别比例、平均活胎体重（雌雄分别统计）、进行外观、骨骼、内脏检查的胎仔数及其畸形胎仔数、外观畸形率、骨骼畸形率、内脏畸形率、枕骨骨化程度。
3.数据统计方法不同指标用不同的显著性检验方法处理。平均体重、平均黄体数、平均着床数、平均活胎数、平均活胎体重用t检验；妊娠率、交配率、受孕率、活胎率用χ2检验；胎吸收率、死胎率、畸胎率用非参数统计。可能时计算剂量——效应关系。
（三）围生期毒性试验的统计指标及数据处理
围产期毒性试验时，可根据试验设计选做如下指标，并做相应的统计分析处理。
1.母鼠体重、饮水量、摄食量、妊娠分娩时间、产仔数、受孕率、死亡率等。
2.仔鼠外观畸形数、外观畸形率、出生存活率、哺育成活率、性别比例、生长指数等。断乳时处死，检查心、肺、肝、脾、肾、睾丸或子宫的重量及内脏畸形的类型和数量。
3.仔鼠生理发育和断乳前神经行为发育测试指标耳郭分离、出毛、门齿萌出、张耳、睁眼、睾丸下降、阴道张开、平面翻正、运动状况、负趋地性、悬崖回避、触须定位、空中翻正、视觉定位等。
4.仔鼠断乳后行为测试指标光电活动笼测试、转棒运动测试、游泳衰竭时间测试、“Y”形迷宫测试、生殖行为试验等。
5.统计方法受孕率、外观畸形率、胎鼠性别等计数资料用χ2检验；体重等计量资料用t检验；仔鼠断乳前以窝为单位统计，断乳后以个体为单位统计。
