再生医学与干细胞进展综述
余东林
(南方医科大学，广东 510000)
摘要干细胞如今在再生医学发挥越来越重要的作用，相关的临床研究也与日俱增。但由于各种条件的限制，使得干细胞的临床应用仍然受到很多阻碍。本文以皮肤修复为切入点，对干细胞相关的研究做一个大体的综述，希望能够给进一步的研究提供一定的帮助。
关键词再生医学；干细胞；皮肤修复
随着机体的更新能力下降，退行性疾病的发生概率不断提高。因为干细胞维持和分化的平衡移动，使得机体得不到及时的补充，在统计层次会有各种病变效应。疾病的新思路，疾病是由于细胞得不到补充而导致的结果，如骨关节炎是由于骨干细胞随着年龄的增长而不断下降导致的疾病易感性增加，因此可以通过补充干细胞也就是干细胞移植来促进健康；利用生物层级模型，越高维度的对象可以起到更大的作用，器官移植可以起到更好的作用，因此人工器官是未来的发展道路，人工器官的关键思路可以更加动态，如运动可以重塑骨骼（持续施加机械力可以有助于模仿骨骼在人体的生长模式，从而能够逼近原有骨骼的性能），我们可以通过施加各种刺激来模拟，不是简单地提供一个支架就让细胞生长，而是需要更多的指导来让其各就各位，这可能就需要一个高维的对象来不断扩增，因为具体的指令太多太复杂，不可能由人来一个个添加，所以构建能够提供指令的环境是更加有效率的做法。假设存在多层级的系统，低维实现高维，即分子形成细胞，细胞形成组织，组织形成器官，器官形成系统，系统形成机体。之后高维指导低维，如细胞层次的微小变化能够导致分子层次的极大改变。
人工器官、器官移植在组织或器官遭受缺损和严重损伤时可以发挥重要作用，但存在术后排斥反应、感染、免疫抑制剂的不良反应、免疫抑制剂费用昂贵以及供体来源困难等等问题。随着干细胞技术的发展，可以通过人工再生与再造来替代受创伤或衰竭的组织和器官：体外培养干细胞，大量扩增，定向诱导分化为特定各种组织细胞满足临床需要，在这个基础上可以进一步构建组织器官。
1干细胞
干细胞按照来源可以分为来源于胚胎和胎儿组织的胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES 细胞）[1]，和来源于出生后器官或成年人体组织的成体干细胞（somatic stem cell）两大类，如神经干细胞、脂肪干细胞、表皮干细胞、间充质干细胞等[2]。
目前已有相关研究来治疗人类疾病，如采用再生医学策略治疗踝关节骨软骨损伤[3]，银屑病[4]，角膜缘干细胞缺乏、老年性黄斑变性（AMD）和青光眼等[5]。骨髓基质干细胞已经探索临床上用于各种不同的疾病，包括骨缺损，移植物抗宿主病、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、神经系统疾病、肝肾疾病的治疗[6]。本文后面会关注移植表皮干细胞到培养表皮细胞片用于治疗烧伤、慢性伤口等等。
1.1逆分化：
在干细胞和再生医学领域取得的重要进展是诱导多能性干细胞技术的出现，我们可以通过建立任何个体的胚胎干细胞，来解决成体细胞存在免疫排斥的问题：山中伸弥利用 4 个转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc可将体细胞重编程为多能性干细胞，即诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cells， iPSCs)[7]。进一步的人ips细胞的建立[8]使得干细胞可能应用到人体，具有更大的临床价值。
但是由于ips技术需要使用病毒载体，具有诱导效率低、外源基因插入及成瘤性等安全性隐患。使用小分子化合物诱导细胞命运转变是更好的选择。如邓宏魁等[9]通过 7 个小分子的组合替代了转录因子将小鼠的体细胞诱导形成多能性干细胞。
具体的机制与化学小分子可以通过影响表观遗传修饰、信号通路等多种途径来调节细胞命运转变过程[10， 11]。通过对机制的探究，为能够有效提高细胞重编程的效率奠定基础。通过化学小分子对靶点进行调节，使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylases，HDACs）在一定程度上提升了小鼠和人成纤维细胞重编程的效率[12]。DNA甲基化酶抑制剂也可以促进体细胞重编程[13]。
通过化学小分子对信号通路进行调节也可以起到影响体细胞重编程进程的作用，如wnt通路能够促进细胞重编程[14]。使用化学小分子抑制剂，如TGF-beta信号通路抑制剂，也可以提高细胞重编程的效率[15， 16]。以上这些还是需要用到转录因子的转入，而邓宏魁等[9]使用小分子的组合就将小鼠的体细胞诱导形成多能性干细胞，不需要转录因子的参与。
化学小分子也可以与转录因子一样在细胞命运转变过程中发挥关键作用，进而介导细胞命运转化，底层的机制在于构造某种等价性，如特定信号通路的影响的综合，生物网络的拓扑结构变化。
1.2转分化：
在某些组织特异性的转录因子的作用下，可以实现不同类型细胞之间的转换，即转分化，能够直接产生功能细胞，不需要先逆分化为多能干细胞再诱导分化为具体的成熟细胞[17， 18]。和多能干细胞的构建过程相似，如九个转录因子可以直接将sertoli细胞转化为多能神经干细胞/祖细胞，其与正常神经干细胞具有相似的基因表达谱，并且在体外和体内均有功能[19]。
同样的，也可以利用小分子的组合来替代转录因子的作用，实现转分化。如使用小分子化合物的组合将小鼠和人成纤维细胞转分化为神经元[20]，将人成纤维细胞转分化为具有功能的心肌细胞[21]。
小分子化合物不仅可以完全替代谱系相关转录因子，也可以单独将细胞命运转变到特定状态，我们可以视为不同细胞之间映射的构造，理论上能够在任意细胞之间构造特定的转换，具体的函数构造可以利用函数展开为级数的思路分解为一系列的特征，细胞A*措施B=细胞C对应于特定的处理措施可以是不同的信号通路或者基因蛋白质的选择性表达。根据中值定理，理论上会存在特定的不动点能够实现这种特定的映射，起到四两拨千斤的作用。这个函数的构造过程，和神经网络算法的权重收敛其实是等价的。因此我们可以通过构造神经网络来实现这种映射。组学层次的数据可能能够允许我们训练出的神经网络，能够体细胞重编程、定向分化或转分化、干细胞不同多能性状态的维持选出特定的分子组合，实现我们想要的任意细胞类型的转换。细胞重编程机制的探究有利于个性化疗法的开发，其中一种方法是谱系重编程，由多个谱系特异性转录因子的转基因表达直接转化成另一种成体细胞。另一个策略使用通用转录因子来产生能够根据特异性分化因子分化为体细胞，是表观遗传学上不稳定的中间体[22]。在数学其实就可以等价为矩阵的变换，因此利用相关的算法，我们可能能够获得大量的细胞，用于再生医学的应用。目前深度学习在很多领域都得到应用，我们认为在细胞重编程机制研究也可能发挥一定的作用，尤其是计算生物这方面[23]。
1.3挑战：
再生医学引入临床的诸多挑战之一是选择最佳的细胞类型和可靠的扩增细胞数量的方法[24]，但是供体的相关参数如年龄对干细胞效价的影响是很重要的，供体的年龄以及干细胞的培养代数会影响自体干细胞治疗的效果[25]。同时安全性需要得到进一步的保障[26]。
1.4发展策略：
寻找促进细胞分化的方法，增加细胞产量和保证产品标准化，克服致畸作用和免疫反应的风险，使移植的细胞或组织直接移植，避免涉及国家规定的法律问题[27]。
2干细胞的应用
我们将重点放在皮肤干细胞的应用，尤其是皮肤机械性损伤或者烧伤之后的修复。
2.1皮肤机械性损伤：
创伤修复其实就是恢复原有不同细胞之间的分布，类型，数量，位置，从而能够恢复原来的动态平衡：不同类型的细胞维持在一定的数量，但是在特定条件下能够相互补充[28]。我们首先考虑基于生物活性因子的无细胞技术，如注射凝胶，或者生长因子，或者其他生物材料，在使用方面易于利用，即用性好，相对成本低以及患者满意度高[29]。但仍然存在一系列的缺陷：持续时间短，需要频繁重复施加处理[30]。
本质上这些处理都是通过诱导宿主组织的重建来实现对创伤的愈合，注射这些生物活性分子，可以调节局部细胞的功能，同时通过趋化作用将细胞积聚到特定区域，可以部分代替原有组织的功能。因为生长因子和细胞因子可以影响细胞基因表达，增殖，迁移和分化的信号，从而调节细胞功能。有研究发现生长因子有助于加快糖尿病足溃疡的愈合速度和时间[31]。
富含血小板的血浆（PRP）是一种血小板浓缩物，含有多种生物活性分子，是生长因子的替代方法[32]，也可以起到治疗糖尿病溃疡的作用[33]。
我们还需要考虑细胞外基质的作用：细胞外基质能够通过暴露原有隐藏的细胞信号位点，促进细胞迁移来起到影响细胞行为的作用[34]，并且通过缓慢释放和延迟生长因子降解来发挥影响信号的作用[35]。
我们还需要考虑更底层的分子以及信号通路的作用，创伤的修复重点在于特定类型的细胞的迁移和黏附，其中黏附通过integrin-β1保持，从而激活EpiSCs的非分化信号[36]。即如果想要EpiSCs保持在干细胞巢niche中，想要激活足够多的integrin[37]。在integrin-β1缺失的小鼠中，细胞增殖持续，但迁移能力受损，细胞在创伤边缘积聚[38]。因此用于细胞贴片的基质需要能够促进integrin表达来促进细胞黏附。当然，我们也需要在细胞迁移到特定部位之后才保持这种相对稳定的位置。
2.2烧伤：
细胞贴片能够提高烧伤病人生存率[39]，但是也具有一系列的缺点：黏附，整合效率不高，外观和功能不全，以及持久性不高[40]。而且因为成分过于简单，无法实现特定的细胞信号[41]。
脂肪移植可能是一个办法，将脂肪细胞转移到天然基质中，如从腹部，臀部等等脂肪富集的部位提取脂肪细胞，转移到受损部位。由于其含量丰富以及没有免疫排斥的危险，可以用来探索皮肤损伤修复，如改善黑眼圈[42]。
我们理想的情况是恢复原有细胞一系列的信号，通过细胞贴片的基质成分和细胞成分来模拟原有的环境，不断逼近。当然要做到一模一样是不可能的，但是将这个目标视为一个函数，我们可以构造出高维的原函数来实现，即表皮干细胞移植。我们不需要直接构建出成熟的成纤维细胞，脂肪细胞等等的架构，利用干细胞可以分化成多种类型细胞，容易体外扩增，并具有体内自我更新能力的性质，让其自动根据环境信号增殖分化，其适应性生长的结果可能就是能够恢复原有组织的功能。我们赞同自然不做无用功的说法，一切往能量最低的方向移动，可能健康组织就是这种能量最低的状态，因此干细胞能够往这个方向发展，在特定的部位分化为特定类型的细胞，从而起到一定的功能。
脂肪移植可能有效果是因为脂肪组织含有多能脂肪组织衍生干细胞（ADSCs），可以成为脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞和其他间充质细胞[43]。并且可能与ADSCs的分泌因子相关，其对邻近的具有旁分泌作用，诱导I型和III型胶原和纤连蛋白的上调以及基质金属蛋白酶-1的下调。也可能刺激血管生成并抑制炎症[44]。
一方面我们可以从病人身上直接提取正常部位的表皮干细胞，通过体外培养增殖最后用于制造细胞贴片；另一方面，在某些特殊情况如重度烧伤的时候，我们可以利用其他的体细胞来逆分化为诱导多能干细胞细胞然后在特定条件下分化，或者转分化为表皮干细胞。使用结缔组织生长因子（CTGF）和TGF-β1可使干细胞逐步分化成纤维细胞并随后分化为肌成纤维细胞[45]。
在细胞贴片中富含皮肤干细胞能够促进功能改善表现，减少疤痕形成，并且能够长期自我更新。但最后干细胞耗竭可导致移植失败[46]，我们可以观察到低表皮干细胞含量与细胞贴片失败相关[47]。
3结语和展望
哺乳动物的再生能力是被得到证明的。具体的分子机制也被探索，如胚胎不能形成伤疤，有TGF-β1的低表达和TGF-β3高表达[48]。这对我们可以有一定的启发即通过各种措施使得受损部位表达模式与胚胎相似，如应用人参皂甙Rb1（一种潜在的TGF-β1抑制剂）实现TGF-β1的低表达，能减少兔模型中瘢痕的α-SMA和Ⅰ型胶原[49]。但并非对这些分子机制的简单拮抗就能够在临床上起到好的疗效，如TGF-β3 (Avotermin)的使用在III期临床试验没有起到很好的减少伤疤效果[50]。
因为机体系统是很复杂的体系，往往牵一发而动全身，我们可能需要靶定更多的分子才能起到比较好的相关，如同山中伸弥转入四个转录因子使得成纤维细胞逆分化为多能干细胞细胞[7]。也可以理解为何大一的鸡尾酒疗法[51]。当然，这也是有小概率存在能够起到很大作用的药物靶点，如治疗黑色素瘤的单抗Keytruda，这种疗法通过结合肿瘤细胞表面用于免疫逃避的PD-1蛋白质，阻断PD-1/PD-L1信号通路使癌细胞死亡[52]。我们可以认为这是可以起到四两拨千斤的更加关键的中心节点，而根据生物网络的幂律分布（连接度高的节点少，连接度低的节点多），我们得知这种靶点是很少的，更多的是有小相关性的节点[53]。
干细胞的应用前景广泛，如表皮干细胞表现出的可塑性超过正常细胞，在小鼠囊胚注射后，表皮干细胞能够分化为所有三个胚层[54]。即使是其他部位的上皮损伤也可能发挥作用如如角膜和尿道[55， 56]。这种细胞贴片或者细胞移植，都存在缓慢的血管化和细胞对缺血的高敏感性，是降低移植物存活率的障碍。安全问题，如肿瘤发生，同样需要在动物模型中进行探索[29]。
结论：
本文综述了干细胞在当今再生医学可以发挥重要的作用。为了解决干细胞的来源，有诱导多能干细胞和细胞转分化的方法，两种都可以通过病毒转入转录因子或者小分子组合诱导。并且结合皮肤创伤的细胞贴片方法来证明干细胞的临床潜力，以此说明干细胞疗法的优越性。而且也为进一步的人工器官建立打好基础。
参考文献(references)
